复叶耳蕨总黄酮对BMSCs定向成骨样分化作用的影响及分子机制的研究-外科学(骨外)专业论文.docx

摘要 摘要 万方数据 万方数据 摘 要 第一部分 复叶耳蕨黄酮对骨髓间充质干细胞增殖和定向 成骨分化的影响 目的：体外建立大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的培养体系，探索复叶 耳蕨总黄酮促进 BMSCs 成骨分化的的可行性。 方法：取 3-4 周健康清洁级 SD 大鼠，采用全骨髓差速贴壁法体外培养 BMSCs, 倒置相差显微镜观察细胞形态和流式细胞仪检测 P3 代细胞表面标志物 CD44、 CD45 、CD90 和 CD11b/c-,鉴定骨髓间充质干细胞。取 P3 代 BMSCs,根据诱导条件不 同分为不同组别,实验中记录细胞形态和功能改变,分别在第 3、6 和 9 天测定细 胞内碱性磷酸酶活性（ALP）、矿化结节染色，RT-PCR 检测 Col1、OPN、OCN 和 OSX 基因 mRNA 的动态变化。 结果：原代细胞首次换液去除悬浮细胞后，呈现圆形贴壁细胞，4d-9d，长 梭形或扁平形细胞增殖迅速，可见呈放射状的集落细胞，12d-14d，细胞紧密排 列融合，呈典型的涡旋状或鱼群样生长。P3 代 BMSCs 大致与原代细胞形态相似， CD45 和 CD11b/c-呈阳性，阳性率分别为 91.96%和 91.0%。而 CD90 和 CD44 呈阴性， 阳性率为 0.32%和 1.37%，BMSCs 均一性好，纯度达 90%以上；诱导 9 天后， 细胞增殖减弱，活性增加,细胞透明度明显降低,黑色团块增多,并呈铺路石样。随 着成骨样诱导时间的延长,细胞内碱性磷酸酶活性呈明显的上升趋势,成骨细胞 特异性分泌物 Col1、OPN、OCN 和 OSX 的基因转录和表达明显增加。 结论：复叶耳蕨总黄酮可促进 BMSCs 向成骨样细胞分化，分化过程中 Wnt/β-catenin 信号通路和 BMP 信号通路活性增高。 关键词：复叶耳蕨总黄酮；骨髓间充质干细胞；Wnt/β-catenin 信号通路； BMP 信号通路；成骨分化 II 第二部分 复叶耳蕨黄酮促进骨髓间充质干细胞定向成骨 分化的机制 摘 要 目的：研究复叶耳蕨总黄酮对大鼠骨髓间充质细胞定向成骨分化的影响以 及相关信号通路。 方法：取 P3 代细胞，方法与第一部分相同,并检测 BMSCs 诱导分化过程中 的 WNT 通路和 BMP 通路的相关因子 mRNA 转录和表达。 结果：体外培养的细胞表达 BMSCs 细胞表面标志；复叶耳蕨总黄酮能提高 BMSCs 分化为成骨细胞，增强 ALP 活性、钙结节形成以及相关蛋白的表达、上 调 WNT 通路和 BMP 通路以及骨桥蛋白、骨钙蛋白和 I 型胶原的 mRNA 的表达。 结论：复叶耳蕨总黄酮能够上调 BMP 信号通路和 WNT 通路促进大鼠骨髓 间充质干细胞定向分化为成骨细胞。 关键词：复叶耳蕨总黄酮 骨髓间充质干细胞 WNT 信号通路 BMP 信号 通路 成骨分化 III Abstract Abstract ABSTRACT The first part Effects of Total Flavonoids of Arachniodes on osteogenic differentiation and proliferation of Rat bone marrow mesenchymal stem cells Objective：To establish a system of cultured Rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) to explore the feasibility of osteoblastic differentiation of BMSCs in an environment containing Arachniodes total flavonoids in vitro. Methods：BMSCs were harvested from 3,4-week-old Sprague Dawley rats by the method of whole bone marrow differential adhesion. Cell morphology was observed under inverted phase contrast microscope and flow cytometry assays surface markers CD44, CD45, CD90 and CD11b / c- of P3 generation of cell to identify bone marrow mesenchymal stem cells. BMSCs at passage 3 were divided into different