根癌农杆菌介导的rolB基因转化烟草的研究-林木遗传育种专业论文.docx

申高称此新统式等 学位论文原创性声明 本人郑童声明 t 所里变的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。 除了文中特别加以标搜寻!用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰 写的成果作品，也不包含为获得中南林业科技大学戒其他教育机构的学位或证书所使用 过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式表明。本 人究全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名 :21|在 ν 10 年 f 月收日 中晶体jt.斜我式等 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校布关保留、使用学位论文的规定，阿意学校保留并向罔家 有关部门或机构送交论文的复印件成电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权中南林 业科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文. 本学位论文属于 1 1、 保密口，在年解密后适用本授权书。 2、 不保密口. (请您在以上相应方桩打 ./ ) ，.飞 J 守t: tt _ / 作者签名 :JII彭 导师签名:{/\， 勺 ν。(-:年J 2-.日 y (.，年 .r 月2炉 学位论文版创性声明与版权使用授权书示例(送审时用) - 摘要 本研究首先以烟草的带芽茎段为外植体进行不定芽的诱导分化、生长及生根 成苗试验。在组织培养的各个阶段的培养基中，附加不同种类及不同质量浓度的 激素组合，观察测量外植体在各种培养基中的生长情况，从中筛选出最优的激素 配比培养基，从而建立了烟草的高效植株再生体系。在此基础上，将不同质量浓 度梯度的卡那霉素加入叶片的愈伤组织及不定芽分化阶段的培养基中，观测卡那 霉素对外植体生长的影响，以确定各阶段的最低致死质量浓度，用于烟草的遗传 转化研究。然后对根癌农杆菌介导的 ro/B基因烟草的遗传转化的条件进行了深入 探索，在对影响根癌农轩菌转化效率的多种因素比较研究后，发现选择合适的预 培养天数、菌液浓度、侵染时间、共培养天数和抗生素的浓度均直接影响根癌农 轩菌转化的效率。通过优化这些转化条件，建立了烟草遗传转化的系统。最后在 此基础上，对转基因烟草进行 PCR检测，验证rolB基因的插入情况。研究结果摘 要如下: 1.烟草组培再生体系的建立: 消毒的最佳方法为先用 75%酒精漫炮 lmin ，再用0.1%氧化放浸泡 7min。 最佳诱导不定芽的培养基为 MS+6日AO.5m以汁1日AO.lmglL0 生根培养的最佳培 养基为 1I2MS+ NM l.OmglLo 移栽炼商以士壤:蛙石 z 珍珠岩=2: 1: 1作为最 佳慕质。 2. 烟草遗传转化体系的建立 试验结果表明:烟草叶片预培养徊，将处于生长对数期的农杆菌菌液稀释 30 倍，侵染 5min 后，共培养 3d，然后在含50仙nglL 竣节背毒素、 8伽gIL卡那 霉素的诱导分化培养基上进行筛选，长出抗性芽后再进行生根筛选，iiJ获得商转 化效率。 本实验对根癌农杆菌转化条件进行了比较系统的研究，是为了建立转化效事 商、稳定性好的烟草农轩菌转化技术体系。 3. 转基因植株的分子检测 对烟草转化榄株的检测主要采用 PCR 方法。以抗性植株的总 DNA 为模板， 以来转化的植株为阴性对照，以质粒 DNA 为阳性对照，利用外源基囚的特异引 物进行 PCR 扩增。 结果表明，转基因植株扩增的条带和质粒中的目的条带一致，而未转化植株 没有扩增出任何条带， 66.7%的抗性植株为 PCR 阳性植株，这就证明了 ro/B 基 因巳转化并整合到烟草基因组中。最后再对转基因烟草及后代的表型形态和细胞 学观察，证明外源基因巳整合到烟草基因组中并能稳定遗传给下一代。 关键词:烟草 ;rolB 基因:转基因植株:根癌农杆菌:遗传转化:遗传规律 H ABSTRACT The 叫or objective of this s阳dyw础 to breed tobacco varieties were selected as experimen时 materia1s. Theirωtyledons were usedωexplan阳 ω 由at an experiment ∞uld be ∞nducted on the induction and differentiation ，the grow白， and the rooting of adventitious buds. As different hormones with various mass-∞ncentrations were added into the media used for each stage of tissue culture，也.e grow也