低温胁迫下桑树MaWAP表达分析与生理生化指标测定-生物化学与分子生物学专业论文.docx

江苏科技大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明： 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名：孙银苹 日期：2012 年 6 月 4 日 学位论文使用授权说明 本人完全了解江苏科技大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 （保密论文在解密后遵守此规定） 论文作者签名：孙银苹 导师签名：刘利 日期：2012 年 6 月 4 日 学号：092300006 摘要：桑树在我国有悠久的栽培历史，除作为蚕饲料外，还具有食用、药用等多 种价值。我国桑树资源极为丰富且品种繁多，然而寒害却是制约桑树产量及分布 的重要因素之一。桑树抗寒机制的研究是探索防寒措施的理论基础，已有长期的 研究历史，然而对桑树抗寒机制的研究多集中在桑树形态指标及生理生化指标等 抗性指标的测定，而对其抗寒功能基因及其所编码蛋白的了解甚少。因此，从分 子水平对桑树抗寒机理进行研究是一项紧迫而有意义的工作。 本文以四种不同地理来源（江苏、广东、新疆、吉林）的桑树为材料，采用 RT-PCR 方法获得四种桑树的低温诱导基因 WAP27/WAP25 同源序列，命名为 MaWAP。利用 RT-PCR 方法研究了低温胁迫过程中四种桑树低温诱导基因 MaWAP 的表达模式，并对 MaWAP 进行原核表达；另外，分别测定了低温胁迫 过程中四种桑树中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD) 的活性及丙二醛(MDA)含量。 序列分析表明，从四种桑树中获得的 MaWAP 基因大小均为 681 bp，编码 226 个氨基酸，预测蛋白分子量为 24 KDa。氨基酸序列比较显示，四种桑树 MaWAP 基因存在基因及蛋白水平的多态性，推测由桑种属不同引起。Blastn 同源比对表 明该基因序列与已报道的 DQ104333.1 、 AF326119.1 有 99% 的 同 源 性 ， 与 AF326120.1 有 98%的同源性，而与其他物种的同源性很低。Blastp 氨基酸序列 相似性表明该基因编码氨基酸序列与 DQ104333.1、AF326119.1、AF326120.1 的 相似性分别为 99%、98%、97%，此外，该序列还与其他物种的 LEA 蛋白有一 定的相似性，推测桑树 MaWAP 可能为 LEA 家族成员。 基因表达分析显示：在未经低温胁迫的叶片中，该基因在向海实生桑中表达 量最高，其次是新疆实生桑、丰驰桑，在广东杂交桑中不表达；随胁迫时间延长， 该基因在四种桑中的表达量均表现出先升高再降低趋势；低温胁迫最后一天，该 基因在广东杂交桑中不表达，在丰驰桑及新疆实生桑中微量表达，在向海实生桑 中的表达量仍然最高。 桑树低温诱导蛋白原核表达表明，该蛋白分子量约为 27 KDa。 低温胁迫过程中，SOD、CAT、POD 的活性及 MDA 含量测定结果如下： 1.丰驰桑和广东杂交桑的 SOD 活性呈先上升后下降变化趋势，新疆实生桑 和向海实生桑的 SOD 活性经短暂下降后波动性升高；在未经低温胁迫叶片中， 四种桑叶片中 SOD 活性相差不大，但低温胁迫 18 天后，新疆实生桑和向海实生 桑中的 SOD 活性明显高于丰驰桑，广东杂交桑中 SOD 活性最低。 2.四种桑中 CAT 活性均先降低后升高。新疆实生桑和向海实生桑中 CAT 活 性总体高于丰驰桑与广东杂交桑。 3.丰驰桑、广东杂交桑和新疆实生桑中 POD 活性均先升高后降低；向海实 生桑的 POD 活性呈波动性上升趋势。低温胁迫后期，新疆实生桑与向海实生桑 中 POD 活性高于丰驰桑与广东杂交桑。 4.四种桑的叶片中 MDA 含量均明显升高，与对照相比，四种桑中 MDA 含 量升高倍数由高到低排列为：广东杂交桑、丰驰桑、新疆实生桑、向海实生桑。 其中向海实生桑中 MDA 含量始终维持较低水平。 由以上结果可初步推断，四种桑抗寒性能由高到低为：向海实生桑、新疆实 生桑、丰驰桑、广东杂交桑，这一结果与 MaWAP 的表达模式相验证，提示 MaWAP 在桑树抗寒功能中起到重要作用。 关键词：桑树；不同地理来源；低温诱导基因；克隆；表达分析；原核表达；生 理生化指标 Abstract: Mulberry has a long culture h