第二章药源微生物与微生物药物筛选技术.pptVIP

微生物制药Microbial Pharmaceutics 主讲教师：陈静博士 山东轻工业学院食品与生物工程学院 讲授内容 第二章 药源微生物及微生物药物的筛选技术 第一节 重要的药源微生物类群 一、放线菌 二、芽孢杆菌属 三、假单胞菌属 四、粘细菌 粘细菌次级代谢产物的特点 （1）种类多 （2）结构新 （3）衍生物多 （4）化合物产生菌株的特异性不强 （5）作用对象特别 五、曲霉菌属和青霉菌属 六、海洋微生物 七、极端微生物 第二节 药物微生物的筛选技术 新 微 生 物 药 物 筛 选 流 程 三、发酵 第三节详细讲解 四、活性测定 抗菌药物：非致病菌为对象，采用琼脂扩散法测定活性，筛选生物活性物质。 也可以使用耐药和超敏菌种。 抗癌药物：细胞实验 五、化合物的分离纯化 第三章详细讲解 六、产物结构鉴定 用HPLC、LC－MS、NMR等，分析鉴定活性物质。 其他现代的筛选技术如靶向筛选、高通量筛选、高内涵筛选等可以结合使用。 七、微生物鉴定 1、形态学 2、生理生化 3、分子生物学方法 第三节 药物筛选的发酵转化工艺 一、影响次级代谢产物合成的因素 2、金属离子 许多金属离子能够刺激次级代谢产物的产生，可能发生在转甲基（Co 2+ ），降解过程（Cu2+，Mg 2+ ），以及其他反应步骤中。 表2-1 金属离子对微生物生物活性次级代谢产物合成的影响 3、前体物质 虽然机制还不是很清楚，但研究发现，加入氨基酸、短链脂肪酸、或者醇类，通常可以刺激次级代谢产物的产生。这种增强作用可能是添加物形成了目标化合物的合成前体。 4、胞内诱导物 微生物次级代谢产物的生物合成常常受胞内低分子量的诱导物质的调节。 表2-2 诱导微生物活性次级代谢产物合成的胞内因子 5、pH 在生长允许的范围内，pH对微生物次级代谢产物产生的影响很大。一些研究发现，微生物生长的最适pH并不是次级代谢产物合成的最适pH。 通常通过向培养基中添加无机酸、CaCO3、磷酸盐、氨水或Na2CO3来调节pH。 举例： 在杆菌肽的合成过程中，添加短连脂肪酸会引起菌体和次级代谢产物产量同时下降。 6、温度 据报道，一株嗜冷链霉菌在15℃时可产生一种抗细菌的代谢产物A-60，但在28℃由于产生了一种可使A-60失活的酶而不能产生该产物。 7、通气和搅拌 氧气是好氧微生物生长所必需的，可以通过摇床摇动、通气、或搅拌使氧气溶解在液体培养基中。对个别微生物来说，不同的溶解氧对生物活性产物的产生有很大的影响。 举例： 一株链霉菌500r/min转速时，枝肌醇霉素和氯癌霉素同时合成，而在 250r/min时，这两种物质都不能合成，但合成链丝霉素。 8、渗透压 对于海洋微生物和陆地微生物来说，可以耐受的NaCl浓度是不同的。嗜盐菌生长3%-5%的NaCl浓度，而陆地微生物低于2%。 在常规的发酵中，真菌和链霉菌的菌丝体会互相缠绕形成各种大小的菌团。因此常加入沸石、硅藻土、高岭土和其他天然矿物质颗粒。 环糊精添加 例如加入0.2%-1.0%的β-环糊精可以提高兰卡杀菌素的产量大约10倍。 二、发酵条件的选择 表2-3 次级代谢产物生产的典型培养基的组成成分 2、含高浓度磷酸盐的培养基 尽管低浓度的磷酸盐培养基有利于次级发酵代谢产物的合成这一观点被广泛接受，但是含有1%-2%无机磷酸盐的高浓度磷酸盐培养基也被成功地用于发酵生产硝吡咯菌素。 2%的无机磷酸盐使得硝吡咯菌素的合成变得更具重现性和更高的产量。 3、含高浓度其他盐的培养基 鉴于无机磷酸盐对微生物次级代谢产物的生物合成的普遍抑制作用已被充分证明，所以高浓度磷酸盐培养基被认为是一种极端的发酵条件。同样，高浓度的其他盐也可能形成这种有利于次级代谢产物合成的极端发酵条件。 例如：如A-60只在硫酸镁浓度高于2%的条件下才产生。 但是有关高浓度盐强烈刺激微生物次级代谢产物合成的机制现在还不清楚。 4、pH碱性的培养基 有些微生物可以在pH碱性条件下生长，并产生碱性胞外酶。许多放线菌和真菌属于这类嗜碱微生物，在碱性条件下这类菌可产生新的次级代谢产物。 如新型抗细菌和抗真菌肽No.1907的发现，是从生长在pH11培养液中发现的。 5、拟混合培养 通过两种微生物的混合培养来获得新的化合物，可能是一株菌产生了一种生物学上没有活性的代谢物，这种代谢物可以被第二株菌变成有活性的化合物。 然而这种方法的大规模筛选可能存在困难，如微生物个体生长速率等。 有一个混合发酵实验：一个镰刀菌菌株在培养基中生长4天后，将上清夜过滤除菌，加入2%的葡萄糖，然后接入各种微生物培养后发现在有的培养中出现了抗细菌活性，但在镰刀菌培养液中没有抗菌活性。 6、前体指导的生物合成 次级代谢过程中的酶常常表现出较低的底物专一