十一次目基因CR扩增与检测.pptVIP

分子生物学实验 实验十一 目的基因的PCR扩增与检测 第2周 分子生物学实验仪器设备简介和实验有关内容介绍 第3周 从植物组织提取DNA 第4周 从动物组织提取DNA 第5周 原核细胞质粒DNA的提取 第6周 核酸的琼脂糖凝胶电泳 第7周 紫外分光光度法测定核酸含量和纯度鉴定 第8周 限制性内切酶酶切质粒DNA 第9周 凝胶电泳回收和纯化DNA片段 第10周 细菌感受态的制备 第11周 质粒DNA的转化 第12周 目的基因的PCR扩增与检测 第13周 原核蛋白质SDS电泳 第14周 考试 一、 实验目的： 熟悉PCR方法体外扩增DNA的基本原理，掌握PCR技术的常规操作，了解PCR引物及参数的设计。利用PCR扩增的方法获取用于表达的目的基因（CYP6B6）。 二、 实验原理： PCR扩增是一种类似于DNA的天然复制过程，以待增的DNA为模板、在体外由引物介导的酶促合成特异性DNA片段的方法。 PCR方法体外扩增DNA的基本原理图示 预变性(双链DNA解链) 94?C, 5min 变性(94?C ,30s-1min) 复性（引物与单链DNA结合） 55?C,30s-1min 延伸(72?C,1-3min) 总延伸(72?C,5-10min) (25-35cycles) PCR的一般过程： 经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。 （1）引物长度应为15~30个核苷酸，Tm可按下列简单公式计算： Tm=（G+C）x 4 +（A+T）+35- 2n （2）引物中碱基的分布应当是随机的，避免出现一连串的单一碱基或产生二级结构。 （3） G+C碱基的含量在45%~55 %左右。 （4）两个引物在3 端均必须与模板互补，5端可以不互补。 （5）引物自身连续互补碱基小于4个。 （6）引物之间连续互补碱基亦应小于4。 引物设计的一般原则 设计和选择高效而且特异性好的引物是PCR的关键 循环参数： ①变性（denaturation） 变性是高温短时， 94?C ，30s-1min。同时在第一轮循环前先进行94℃预变性5min，以便使模板DNA完全解链。 ②退火（annealing） 实际使用的退火温度要比引物的Tm低5℃ 。 退火温度在55~72℃ 之间都会得到好的结果。 ③延伸（extension） 一般引物延伸是在72 ℃下进行。对2Kb长的产品扩增时间多采用1min。 ④循环次数（cycle） 一般为30个循环，如果循环次数过多会增加非特异性产物的量。 1、 55℃ * 30s 90s** 7min 45s 1. 取一个0.2ml eppendorf管，添加以下各种成分反应液 ddH2O 12.1 μl 模板DNA 0.5 μl（20-40ng）原质粒进行1：20倍稀释 上游引物(100μmol/L) 0.3μl 下游引物(100μmol/L) 0.3 μl dNTP mixture(10mmol/L) 2 μl 10倍×缓冲液 2.5μl Taq酶 0.4μl 总体积 20 μl 2. 稍作离心，将反应管放入PCR仪中。 2、 反应体系: (CYP6B6)