TMV、CMV双价抗性RNA沉默表达载体的构建.PDFVIP

中国农学通报 2011,27(05):317-321 Chinese Agricultural Science Bulletin TMV、CMV双价抗性RNA沉默表达载体的构建 1 2 1 2 陈瑜欣 ，高玉龙 ，丁 灿 ，徐照丽 1 2 （云南农业大学农学院，昆明625014；云南省烟草农业科学研究院，云南玉溪653100） 摘 要：本研究以在植物体内转录出RNA 沉默的高效诱导因子双链RNA （dsRNA ）为目标，根据已报道 的TMV ΔMP 和CMV ΔRep 的核苷酸序列设计特异性引物，分别从质粒pBIN-TMV ΔMP(i/r)、 pBIN-CMV ΔRep(i/r)扩增MP 基因、Rep 基因，并在pGEM-T Easy 载体上将2 片段串联起来，再用PCR 扩 增串联好的正反向MP-Rep 基因。正向MP-Rep 基因用BamHI 和Kpn I 切下，将所得基因片段与用同样 酶切开的含内含子的pKAN-In 相连，取名+pKAN ；用同样的方法，将反向MP-Rep 基因用Xba I 切下，将 所得基因片段与用同样酶切开的+pKAN 相连，取名pKAN-In-MP-Rep ，再用Not I 将包括Intron 和正反 向MP-Rep 基因在内的片段切下，将其定向插入同样酶切开的pART27 上，获得重组质粒 pART27-In-MP-Rep。获得的载体可以应用于植物转基因抗病毒育种工程中。 关键词：RNA 沉默载体；烟草花叶病毒；黄瓜花叶病毒 中图分类号：S336 文献标志码：A 论文编号：2010-3152 ConstructionofTMVandCMVBinaryVirusResistantRNASilencingVector 1 2 1 2 Chen Yuxin , Gao Yulong , Ding Can , Xu Zhaoli 1 ( AgronomyCollegeofYunnanAgriculturalUniversity, Kunming 625014; 2 YunnanTobaccoScienceResearchInstitute, Yuxi Yunnan 653100) Abstract:In order to effectively transcribe dsRNA in plants, an inducer of RNA silencing, the specific primers was designed according to the published sequence of TMV ΔMP gene and CMV ΔRep gene. MP and Rep fragment was obtained by PCR amplification respectively using pBIN-TMV ΔMP (i/r) and pBIN-CMV ΔRep(i/ r) as template, then MP and Rep were concatenated and cloned into pGEM-T Easy Vector. Sense MP-Rep fragment was obtained by digesting with BamHI and Kpn I and inserted into vector pKA