环介导等温扩增技术快速检测转基因大豆研究-农产品加工及贮藏工程专业论文.docxVIP

摘要 由于转基因植物存在的安全性问题使得转基因农作物的标签问题成为公众关注的 主要热点，已有 30 多个国家制定了相应的法律法规对转基因作物及其衍生产品进行标 签。目前，许多未经标签和认证的转基因大豆已经进入中国市场，这就迫切地需要合适 的检测手段以确定这些大豆中是否含有转基因成分。 传统的检测转基因大豆的方法操作繁琐、检测时间较长，通常需要 5~7d 才能完成 且检出限较低，不能满足现代检测的需要。所以急需建立灵敏、可靠、快速的转基因大 豆检测方法。 环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是日本的荣 研株式会发明的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等 优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异 的引物，利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒温条件（65℃左右） 下进行扩增。可以在1 h之内，将靶DNA片段扩增109~1010倍。因此，LAMP技术终将会 在检测领域中广泛应用。 本研究针对转基因大豆的特异基因 CP4-EPSPS （ GenBank accession number AY5966948）设计引物，用 LAMP 引物在线设计引物软件设计引物。并对反应温度、 反应时间、镁离子浓度、Bst DNA 聚合酶浓度等扩增条件进行优化，建立 LAMP 反应 体系。 LAMP反应体系如下：F3与B3（LAMP反应外引物）各5 pmol；BIP与FIP （LAMP 反应内引物）40 pmol；其它反应组分终浓度分别为：1.0 mmol/L dNTP，1.0 mmol/L Betaine，4.0 mmol/L MgSO4，2.5 μL Bst DNA聚合酶缓冲液（20 mM Tris-HCl (pH8.8， 25℃)，10 mM KCl，10 mM (NH4)2SO4，2 mM MgSO4， 0.1%Triton X-100），0.4 μL Bst DNA聚合酶，1.5μL目标 DNA，纯水补足体积到25μL。扩增反应条件为61℃保存1 h， 80℃ 2 min使酶灭活。LAMP反应产物在1 %的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统观 察结果，产生预期的梯形条带。 另外，对不同样品分别进行了 PCR 反应和 LAMP 反应来验证引物的特异性，结果 表明：转基因大豆为阳性结果，其它样品均为阴性结果。采用 CTAB 方法制备模板进 行 PCR 和 LAMP 反应，其方法的检出限分别为 0.2%和 0.01%，LAMP 方法的检出限是 PCR 的 20 倍。LAMP 扩增可在 60 min 内完成，对转基因大豆的检测的整个检测过程（包 括 DNA 提取 60 min、LAMP 反应 60 min 和电泳 30 min）可在 2.5 h 内完成。如在 LAMP 反应结束后的产物中加入 SYBR Green I 荧光染剂，通过混合液的颜色可直接判断扩增 发生与否，整个检测时间可在 2 h 内完成，初步建立了转基因大豆的 LAMP 检测方法。 总之，LAMP 检测方法的灵敏度高、特异性好、耗时短，为转基因作物快速检测构 建了良好的技术平台。 关键词：转基因农作物；大豆；环介导等温扩增（LAMP）；检测；核酸 The Study on the Detection of Genetically Modified Soybean Using Loop-Mediated Isothermal Amplification Author:Liu yi Major: processing and storage of agriculture production Supervisor: Professor Zhang wei Abstract Labeling of food from transgenic crops become one of the key issues dominating public due to their safety concerns,and laws or regulations have been issued to label the GMOs and their derived products in more than thirty countries.At present,the genetically modified soybean has entered Chinese market without labeling and claiming, which makes it necessary to confirm the existence