6----菌种的管理和保藏.ppt

菌种的保藏和管理 国家药典委员会 杜平华 前言 试验过程中，生物样本可能是最敏感的，因 为它们的活性和特性依赖于合适的试验操作和 贮藏条件。实验室菌种的处理和保藏的程序应 标准化，使尽可能减少菌种污染和生长特性的 改变。 按统一操作程序制备的菌株是微生物试验结 果一致性的重要保证。 菌种保藏的重要性 菌种保藏是微生物学检验工作中的一项常规技术，菌种的科学保藏和管理直接关系到检验结果的正确性。 菌种的来源 药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种收藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。 菌种保藏的中心任务 ⒈广泛收集各种有用的微生物菌种。 ⒉选择最适宜的保藏方法。 常用菌种保藏方法 菌种保藏的原则 降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本上处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但不至于死亡，以减低菌种的变异率。 常用菌种保藏方法 标准菌株的复活或培养物的制备应按供应商提供的说明或按验证的方法进行。 标准储备菌株 工作菌株 工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用作工作菌株。 不同的微生物，应根据其生物特征来选择最适宜的保藏方法，菌种的保藏方法一般分四个阶段： ⑴?挑选特征典型的菌落。 ⑵确定保藏的合适菌体。 ⑶选择最适宜的方法。 ⑷定期进行检查。 二、菌种的传代和使用 工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过5代，（从菌种保藏中心获得的标准菌株为第0代）防止过度的传代造成菌种变异。 细菌的接种、分离和培养 接种方法 涂布法 划线法 穿刺法 直接加入法等 分离 分离方法主要有分段划线法、连续划线法、涂布分离法、倾注分离法等。 培养 需气菌培养法 厌氧培养法 培养后微生物的生长判断固体培养基：有菌落生长或沿穿刺线扩散生长。液体培养基：浑浊、菌膜、沉淀等。 三、菌种的检查与复壮 菌种的衰退 控制菌种的衰退方法 ⑴控制传代次数 ⑵创造适宜的培养条件 ⑶用不同类型的细胞进行传代 ⑷采用有效的保藏方法 ⑸定期检查 ⑹菌种的复壮 四、菌种的管理 1、使用菌种的单位，应具备从事微生物工作的条件和设备。 菌种应由专人负责管理，管理人员应具有微生物专业知识和技术水平，并应具有较强的责任心。 ⒉实验室必须建立菌种保存和使用文件化的程序管理制度 ⒊详细记录 ⒋建立菌种带出实验室，外单位索取、购买制度 ⒌菌种建立菌种处理操作规程。 菌悬液的制备与保存 菌悬液的制备方法与保存 采用经验证的方法制备菌悬液，除另有规定外，微生物限度试验用菌悬液的制备如下： 1、接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18～24小时. 2、接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时。 上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。 3 、接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7天。 加入3～5ml 含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。 4 、菌悬液制备后应在2小时内使用，若保存在2～8℃的菌悬液可以在24小时内使用。黑曲霉也可制成稳定的孢子悬液保存在2～8℃，在验证过的贮存期内替代对应量的新鲜孢子悬液使用。 * * *