电镜生物技术方法.pptVIP

* 1. 冷冻超薄切片技术 1952年Fernandez 和Moran 首先采用该技术方法。经不断改进和完善，特别是80年代以后国内引进了该技术，从而推动了我国的电镜细胞化学、免疫电镜细胞化学、X-射线微区分析等研究工作的进展。 冷冻超薄切片技术是用快速冷冻固定取代或减少化学固定，取消了有机溶剂脱水、树脂浸透、包埋等步骤 分类 1. 样品不经过任何处理直接冷冻固定，然后进行超薄切片，适用于橡胶、塑料等弹性材料和高分子材料，以及生物材料中进行放射自显影和X射线微区分析的样品； 2. 醛固定和冷冻保护剂处理，然后进行冷冻固定和超薄切片，适用于进行形态学研究和细胞化学、免疫化学研究。 组织：1×1×1mm3 悬液滴 固定：2.5%戊二醛固定液或戊二醛﹢多聚甲醛固定液 清洗：相应的缓冲液 冷冻保护 3%甘油、蔗糖、二甲基亚砜、5%PVP 快速冷冻固定：KF80或MM80 E 冷冻超薄切片 80～100nm 样品温度 -100～-110℃ 刀温度 -80～-90℃ 捞片：饱和蔗糖滴 清洗：蒸馏水 电镜细胞化学染色 电镜免疫细胞化学染色 TEM观察 形态学 电镜细胞化学 免疫电镜细胞化学 重金属染色 冷冻干燥 TEM观察 微量元素分析 形态学 冷冻超薄切片技术 2. 冷冻蚀刻技术 利用在冷冻条件下样品变得又脆又硬时，用刀劈裂样品，断裂常发生在细胞冷冻后较脆弱的部位，多数情况下沿细胞及细胞器的膜裂开； 它既可以在扫描电镜下观察三维立体结构，又可以在断裂后做超薄切片在透射电镜下观察二维平面结构，还可以做冷冻断裂免疫电镜技术。 操作程序：冷冻断裂→蚀刻→复型 特点 该技术能得到膜内部和细胞内部的三维结构像，是研究生物膜大分子结构、细胞连接装置和细胞骨架等结构的有力工具和手段。它还可以与免疫金标记技术相结合产生冷冻断裂标记技术，从而能够显示细胞膜表面大分子物质，如受体、抗体以及其它化学基团的分布情况。 该技术样品制备周期短，还具有分辨力高、断裂面凹凸不平，立体感强、图象清晰、复型膜能耐受电子束轰击和便于长期保存的优点。 冷冻断裂 冷冻蚀刻 在真空中使样品表面的冰升华，暴露出断裂面上细胞的超微结构。 最佳蚀刻深度30nm，深度不够，超微结构没有充分暴露，观察时图像模糊；深度过大，超微结构与基础高低相差悬殊，因支持力不足容易倒塌。 真空，-100 ℃ 冷冻复型 采用电子透明的薄膜将样品表面结构“铸印”下来，复制的这层薄膜就相当于表面结构的一个“模子”，称为复型。 特点：制样简便，不损伤样品，图像立体感强。 常采用45 °角喷铂，90 °角喷碳 制备方法 取材：1 mm ×1mm × 3 mm 固定：1-3 % 戊二醛固定液 2小时 4 ℃ 清洗：1/15 M PBS (pH 7.2-7.4) 冷冻保护：30%甘油-生理盐水 12小时 4℃ 冷冻固定：样品放入LN2中冷冻 断裂：高真空1 ×10 –5 Torr ，样品升温到-100— -110 ℃ 蚀刻：继续升温到 –90 — -100 ℃ ，样品表面冰升华 碳-铂复型膜：喷铂 45°角 1次 喷碳 90°角 3-5次 腐蚀：次氯酸钠溶液腐蚀样品 清洗和捞膜：蒸馏水清洗两次复型膜并捞膜到400目铜网上 心肌细胞膜上的钙离子通道 脂滴与内质网 3. 冷冻置换技术 在低温条件下，使生物样品中结成冰的水分逐步被有机溶剂取代以达到脱水的目的。 它既可以保存细胞生活状态时的良好超微结构，又可以满足免疫电镜细胞化学和细胞X-射线微区分析的要求。 冷冻置换后的样品可以常规包埋，也可经临界点干燥处理，喷镀后作扫描电镜观察。 置换液：丙酮、OSO4 、戊二醛、甲醇等有机溶剂 置换温度和时间：-90℃ 48小时 -30℃ 3小时 0℃ 升温速率：5℃/小时 四. 电镜细胞化学技术 通过酶的特异细胞化学反应显示酶在细胞内的定位的电镜细胞化学称电镜酶细胞化学 。 利用各种化学和物理方法，使细胞内各种成分在原位形成电子密度大的、可见的最终产物，即金属沉淀物，然后借助电子显微镜进行观察分析。 电镜细胞化学技术可以显示的酶多属水解酶、氧化还原酶和转移酶。目前，在细胞超微结构上能够定位的酶约有80多种。 基本方法 取材 —— 组织切成1mm×1mm×2 mm 固定 —— 2%戊二醛（二甲砷酸钠缓冲液）pH7.