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第三章 蛋白质化学(二） Proteion Chemistry 研究蛋白质的一级结构的重要性 第一步：测定蛋白质分子中多肽链的数目 测定末端基（C端或N端），看蛋白质的摩尔数与末端基的摩尔数的比例？ 若　1：1？　 1：2？　1：3？ 第二步：拆分蛋白质分子的多肽链和二硫键 如果是寡聚蛋白质，多肽链（亚基）借助非共价相互作用缔合 　采用变性剂：8mol/L尿素、6mol/L盐酸胍、SDS处理。 如果多肽链通过共价二硫桥（－S－S－）交联 　采用氧化剂或还原剂：将二硫键断裂。 第三步：分析每一多肽链的氨基酸组成 待测样品经酸(6mol/L HCl)和碱(5mol/L NaOH)完全水解。 第四步：鉴定多肽链的C－末端和N－末端 1.N－末端氨基酸分析 2.C－末端氨基酸分析 1.N－末端氨基酸测定 2,4－二硝基氟苯（DNFB或FDNB，Sanger试剂）法 丹磺酰氯(DNS)法 苯异硫氰酸酯（PITC，Edman试剂）法 氨肽酶法是一类肽链外切酶（exopeptidases) 它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。 H2NVal－His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu－Lys COOH 1.N－末端氨基酸测定——与DNFB（FDNB）反应 1.N－末端氨基酸测定 ——苯异硫氰酸酯（ PITC，Edman试剂）法 2.C－末端分析 肼解法 羧肽酶法 还原法 硼氢化锂 能产生游离的羧基末端氨基酸 天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸被破坏 第五步：裂解多肽链成小的肽段 要求：选用专一性强的、断裂点少的、反应产率高的蛋白水解酶 或化学试剂 进行有控制的裂解。 ①酶解法（表现出专一性） ②化学法 溴化氰水解法(CNBr):只断裂由Met残基的羧基参加形成的肽键。Rm=Met。 用羟胺断裂:它断裂－Asn-Gly-之间形成的肽键。 Rm=Asn Rn=Gly 第六步：测定各肽段的氨基酸序列 第七步：重建完整多肽链的一级结构 所得资料： N－末端残基 H　C－末端残基　S 第一套肽段　OUS　PS　EOVE　RLA　HOWT 第二套肽段　SEO　WTOU　VERL　APS　 HO 借助重叠肽确定肽段次序： 　　　　HOWT OUS EOVERLAPS 第八步：确定原多肽链中二硫键的位置 采用胃蛋白酶：专一性低，切点多。肽段比较小，分离、鉴定比较容易。 肽段混合物进行的对角线电泳 对角线电泳 例：有一个A肽？ ①酸水解得到：Ala、Arg、Ser、Glu、Phe、Met； ②当A肽与FDNB试剂反应后得：DNP-Ala； ③当A肽用CNBr降解时得到：游离的Ser和一种肽 ； ④当A肽用胰蛋白酶降解时得到两种肽： 　　　一种含Ala、Arg，　另一种含其它氨基酸 ⑤当A肽用糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）降解时得到两种肽： 　　　一种含Met、Ser，　另一种含其它氨基酸； 　　　问A肽的氨基酸排列顺序如何？ 例：有一个A肽？ 解答 ①酸水解得到：Ala、Arg、Ser、Glu、Phe、Met； 含有这些氨基酸残基 ②当A肽与FDNB试剂反应后得：DNP-Ala； N末端为Ala ③当A肽用CNBr降解时得到：游离的Ser和一种肽 ； 断裂Met残基的羧基 ④当A肽用胰蛋白酶降解时得到两种肽： 　　　一种含Ala、Arg，　另一种含其它氨基酸 Lys或Arg残基的羧基端参与形成的肽键 ⑤当A肽用糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）降解时得到两种肽： 　　　一种含Met、Ser，　另一种含其它氨基酸； Phe、Tyr、Trp等疏水氨基酸残基的羧基端参与形成的肽链 正常细胞 镰刀形细胞 正常型 （Hb-A） ---Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys --- 谷氨酸 镰刀型 （Hb-S） ---Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys --- 缬氨酸 （极性） （非极性） 胶原蛋白（Collagen） 胶原蛋白（Collagen） 肽链主链骨架180°的回折，即U型转折结构 特点： 肽链骨架以180?o回折而改变了肽链的方向； 回折部分由4个连续的AA残基组成 第一个残基C=O 第四个残基NH 甘氨酸和脯氨酸常出现在转角中 O ……（ 氢 键 ）………