高产纤维素酶菌株的筛选、酶学性质及发酵工艺的研究-微生物学专业论文.docxVIP

Screening,Enzyme-producing Conditions Optimized and enzymatic characteristics of cellulose-producing strain with high cellulase activity A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Natural Science By (Resource Microbiology) Dissertation Supervisor: associate Prof. Shihezi·Xinjiang·China June，2015 III  石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果.据我所知，除 文中已经注冽引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果.对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意. 研究生签名是穿 j 时间 )tJ功年 j月 /;;日 使用授权声明 本人完全了解石河子大学有关保留、使???学位论文的规定 ，学校有权保留学位论文并向国家主 管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版.有权将学位论文在学校!l书馆保存并允许被查阅. 有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编 出版.保密的学位论文在解密后适用本规定 . 研究生签名朵身精 导师签名: 苦菜 时间 ).01!5年 j 月 μ，日 时间:品ρr年 6 月/).--百  IV  摘 要 产纤维素酶菌株的分离鉴定及酶学性质:采集新疆吐鲁番火焰山地区土样,从中分离筛选获得 11 株产纤维素酶菌株，得到一株高产纤维素酶菌株 C-8，酶活达到 82.5U/mL，经形态观察、生理生化 及分子检测，鉴定该菌株为芽孢杆菌属（Bacillus sp），菌株生长最适 pH 为 7.0，最适培养温度为 30℃。酶学性质研究发现：该菌株所产纤维素酶的最适反应温度是 40℃，最佳反应 pH 为 6.0，具有 良好的热稳定性和 pH 稳定性；Fe3+具有显著促进作用。 菌株产酶条件优化：利用响应面分析法，对 C-8 发酵产酶条件进行优化。采用 Plackett-Burman 设计筛选影响产酶的主效应因素，利用最陡爬坡试验逼近响应值最大范围以及 Box-Behnken 中心组 合试验进行研究，得到最佳发酵产酶条件：起始 pH8.0、CMC-Na 2.5%、培养温度 28℃。发酵培养 产纤维素酶，酶活最高可达 193.89U/ml，比最初纤维素酶酶活力提高了 2.35 倍。 复合诱变育种获得高产纤维素酶优良菌株：通过紫外线与 NTG 复合诱变，获得 20 株突变株， 其中 UV-NTG-10 酶活力为 266.261U/ mL，酶活力为最高，提高了 3.23 倍；经验证菌株 UV-NTG-10 具有良好的遗传稳定性。研究其所产纤维素酶的酶学性质发现：该纤维素酶最适作用温度为 50℃， 最佳 pH 为 6.0，pH 具有良好的稳定性，而温度稳定性较弱。 突变菌株发酵条件的优化：以复合诱变菌株 UV-NTG-10 产纤维素酶菌株为研究对象，采用二次 正交旋转组合设计研究碳源浓度、氮源浓度和吐温-80 浓度 3 个因素对产纤维素酶的影响，确定最优 发酵条件。结果表明，复合诱变菌株 UV-NTG-10 产纤维素酶的最佳产酶条件为: 麦芽糖为 30g/L， 酵母提取物为 15g/L，吐温-80 为 5g/L。最佳条件下，发酵培养产纤维素酶，纤维素酶酶活可达到 453.20U/mL，必优化前提高了 1.71 倍。 纤维素酶的纯化及酶学性质的研究：采用硫酸铵分级沉淀、透析浓缩和 SephadexG-50 凝胶柱层 析对发酵粗酶液中的外切葡聚糖苷酶进行了分离纯化,纯化后的纤维素酶酶活力提高了 14.65 倍,内 切葡聚糖苷酶的回收率为 23%，相对分子质量为 29KD。最适反应温度为 50℃， 最 适 pH 为 7.0。 动 力 学 参 数 Km 为 2.606umol/L 和 Vmax 为 0.606mmol/L·min。 底物特异性试验，发现该纯化 酶为外切葡聚糖苷酶。其纤维素酶酶活性中心必须基团为组氨酸残基和精氨酸残基。 关键词：纤维素酶；复合诱变；响应面法；酶动力学；诱变育种 V   Abstract Isolation and identification of stra