分子生物学研究方法与基因工程.ppt

分子生物学研究方法与基因工程 1、重组DNA技术发展史上的重大事件 2、DNA操作技术 3、基因克隆的主要载体系统 4、基因的分离与鉴定 5·1 重组DNA技术史上的重大事件 半个世纪以来，分子生物学研究取得了前所未有的进步，主要有3大成就: 第一，解决了遗传的物质基础问题－－基因的分子载体是DNA; 第二，DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题; 第三，“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。 5·2 DNA操作技术5·2·1 核酸的凝胶电泳 1·基本原理 生物大分子在一定pH条件下，通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。 2·琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。经过化学修饰的低熔点琼脂糖，在较低的温度下便会熔化，常用于DNA片段的制备电泳。 5.2.2 核酸的分子杂交 将特定的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段（互补）就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。能够杂交形成杂种分子的不同来源的DNA分子，其亲缘关系较为密切；反之，其亲缘关系则比较疏远。因此，DNA/DNA的杂交作用，可以用来检测特定生物有机体之间是否存在着亲缘关系，而形成DNA/RNA间杂种分子的能力可被用来揭示核酸片段中某一特定基因的位置。 5·2·3 细菌转化 细菌转化：一种细菌菌株由于捕获了外源DNA导致性状特征发生遗传改变的生命过程。 大肠杆菌是分子生物学家常用的实验材料，也是基因工程重要的实验菌株。将快速生长中的大肠杆菌置于经低温(0℃)预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀(形成原生质球)，并与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。立即将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。发生了遗传改变的菌株带着变异而遗传。 5·2·4 核苷酸序列分析 仪器分析发展很快。 如果将来做测序工作，有了分子生物学基础，就可以做。 如果将来工作中需要测序，一般送到公司去测。 下面介绍测序的基本原理。 5·2·5 基因扩增 聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。 PCR技术的原理 首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。因为DNA聚合酶需要有一小段双链DNA来启动(引导)新链的合成，所以，新合成的DNA链的起点，由加入到反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火决定的。 PCR反应的全过程 DNA解链(变性)、引物与模板DNA相结合(退火)、DNA合成(延伸)三步，被不断重复。多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数，即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值是2n。 5·3 基因克隆的主要载体系统5·3·1 质粒DNA及其分离纯化 细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体并能自主复制的遗传成分，质粒都是由环形双链DNA组成的复制子（有少量线性质粒、RNA质粒报道）。质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，也可能在一定的条件下被可逆性整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 5·3·1·1氯化铅密度梯度离心法 质粒DNA一般仅占细胞总DNA的l%～2%左右，而且其化学结构与寄主染色体DNA之间并没有什么差别，所以，质粒DNA的纯化须从两者高级结构上的差异寻找依据。在细胞裂解及DNA分离的过程中，大分子质量的细菌染色体DNA容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA则由于其分子量较小、结构紧密，大部分仍能保持完整的环状结构。 5·3·1·2 碱变性法 在pH值介于12.0～12.5的条件下加热DNA溶液，线性DNA会被变性，而闭合环状质粒DNA则不会被变性，尽管在这样的条件下连接DNA互补链之间的氢键也会断开，但由于闭合环状质粒DNA的双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补的两条链仍然会紧密地结合在一起。与此相反，线性DNA的两条链则会完全分开。若用制冷或恢复中性的方法处理