高表达重组 TCS 对人宫颈癌 Caski 细胞p73基因甲基化影响的机制研究-妇产科学专业论文.docxVIP

三峡大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均 已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 学位论文作者签名： 日 期： 三峡大学研究生知识产权承诺书 本人承认：我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据 研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。 本人承诺：我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的 全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何 种形式刊发学术论文、进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第一作者单位 或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。 我愿承担因违背上述承诺而引起的一切法津和经济后果。 学位论文作者签名： 日 期： Ⅰ 内 容 摘 要 目的：观察高表达 rTCS 对宫颈癌 Caski 细胞增殖和细胞周期，及甲基化转移酶 I (DNA methyltransferase，DNMT1)的表达和抑癌基因 p73 启动子区甲基化状态的影 响。探索高表达 rTCS 是否能抑制 Caski 细胞生长，是否具有去甲基化作用，能否诱 导 p73 基因重新表达，从而为 rTCS 抗宫颈癌药效及机制研究提供理论依据。 方法：（1）限制性内切酶酶切、琼脂糖凝胶电泳切胶回收、T4 连接酶连接等方法 构建真核表达质粒 pcDNA3.1(-)/6xHis-TCS。（2）反转录 PCR（RT-PCR）、实时定量 PCR（FQ-PCR）、蛋白免疫印记（Western-blot）筛选高表达 rTCS 的 Caski 细胞株， 及检测 DNMT1 和 p73 的表达情况。（3）MTT 还原测定法比较分析细胞生长情况。（4） FCM 用于分析细胞周期变化。（5）甲基化特异性 PCR（methylation-specific PCR, MSP） 法检测 p73 基因 5ˊ端启动子区 CpG 岛甲基化状态的改变。 结果：（1）成功构建 rTCS 真核表达质粒 pcDNA 3.1(-)/6xHis-TCS，将此质粒转 染 Caski 细胞株，经 G418 筛选，RT-PCR 和 Western-blot 鉴定，获得高表达 rTCS 的 Caski 细胞株。（2）高表达 rTCS 的 Caski 细胞（实验组）增殖速度明显低于对照组， 二者在 24h、48h、72h 均具有显著性统计学差异 (p0.01)；FCM 结果显示：实验组 细胞 G1 期和 G2 期细胞数比例高于对照组(p0.5)，而 S 期较对照组低（p0.01），差 异具有统计学意义。（3）实验组细胞 DNMT1 在 mRNA 及蛋白水平的表达均低于对 照组，其中 mRNA 水平降低 0.56 倍（p0.01）。（4）实验组细胞 p73 基因启动子甲基 化程度比对照组细胞有所降低，而 p73mRNA 表达水平高于对照细胞。 结论：（1）rTCS 高表达能够显著抑制 Caski 细胞增殖并能将细胞抑制在 G1 和 G2 期，且随时间延长，抑制程度增加。（2）高表达 rTCS 能够显著抑制 Caski 细胞中 DNMT1mRNA 及蛋白水平的表达。（3）高表达 rTCS 能够逆转 Caski 细胞中 p73 基因 的甲基化状态，从而诱导其重新表达。（4）在 Caski 细胞中高表达的 rTCS 可能通过 抑制 DNMT1 的表达，导致 p73 抑癌基因启动子去甲基化而重新表达，从而抑制宫颈 癌 Caski 细胞增殖。 关键词：重组天花粉蛋白 p73 基因 宫颈癌 DNA 甲基化 Ⅱ Ⅲ Ⅲ Abstract Objective: To study the effect of high expression of rTCS on the proliferation and cell cycle, DNMT1 expression and methylation of p73 promotor in Caski cell line. To evaluate whether high expression of rTCS could inhibit the growth of Caski cell and induce p73 re-expression by demethylation of p73 promotor.To porvide a new pathway for the therapy of cervical cancer. Methods: (1) Eukaryotic ex