eif4e在人非细胞肺癌中的作用及其对pim-1表达调控的实验研究.docxVIP

河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学 位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医 科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要 内容相关的论文，第一署名为单位河北医科大学，试验材料、原始数据、 申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应法律责任。 ．ii‘一。j； 研究生虢自矾翮擗榉二级学院领导耐’纂}；『 劢萨乡月；1日 河北医科大学研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究 成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。 研究生签名： 导师签章： ．簟螭’ 锄l多年弓月；1日 万方数据  目 录 中文摘要 1 英文摘要 6 英文缩写 12 研究论文elF4E在人非小细胞肺癌中的作用及其对Pim一1表达调控的实 验研究 前言月|J舌 1313 材料与方法 14 结果 22 附图 27 附表 37 讨{仑 44 结论 47 参考文献 48 综述elF4E在肿瘤中的表达和研究进展 50 致调j 60 个人简历 61 万方数据  中文摘要 elF4E在人非小细胞肺癌中的作用及其对Pim．1表达调控 的实验研究 摘 要 目的：在全球范围内，肺癌的发病率及死亡率位于常见恶性肿瘤的前 列，揭示其病因及发病机制对于肺癌的有效治疗意义重大。我们前期研究 表明，Pim．1在非小细胞肺癌组织(Non．small—cell lung cancer,NSCLC) 中过表达，并且其过表达可以促进NSCLC细胞的增殖以及肿瘤迁移等过 程，发挥癌基因的作用。但是，目前有关Pim．1在NSCLC中过表达的机 制尚不清楚。真核细胞翻译起始因子4E(elF4E)作为重要的真核细胞翻 译起始因子，可增加一些癌基因在蛋白水平的合成过程。elF4E是否参与 NSCLC中Pim一1的表达调控尚不清楚。鉴于此，本实验旨在研究elF4E 在NSCLC中的表达及作用，同时分析elF4E对Pim一1表达的调控作用。 方法： 1免疫组织化学方法 采用免疫组织化学Elivision Mplus三步法，检测Pim一1与elF4E蛋白 在福尔马林固定石蜡包埋NSCLC组织中的表达。在此基础上，分析Pim—l 与elF4E表达与临床病理学特征的相关性，并对二者表达的相关性进行分 析。 2细胞培养 人肺癌细胞H1299、A549、H157、H460和H358，培养于含10％J抬 牛血清、100 U／ml青霉素、100 U／ml链霉素的1640培养基中，37。C、5％ C02培养，细胞贴壁生长。取对数生长期的培养细胞，用0．25％胰蛋白 酶+O．02％EDTA消化，进行细胞传代以及细胞的收集，进行相关研究。 3 siRNA转染 使用100 pmol elF4E特异性siRNA瞬时转染H1299和A549细胞， 同时转染Negtl‘ve control siRNA(NC siRNA)作为阴性对照。体外观察 eIF4E在NSCLC中的作用及对Pim—l的表达的影响。 4 MTT比色法 分别于eIF4E siRNA转染后Oh、24 h、48h、72h和96h，采用MTT 万方数据  中文摘要 方法检测对H1299及A549细胞的生长情况；不同浓度吉非替尼处理48h 后进行MTT检测，绘制细胞生长曲线并计算半数抑制浓度(IC50)。此外， 分别于Pim—l siRNA或eIF4E siRNA转染联合吉非替尼(gefitinib)处理 细胞后进行MTT检测。 5蛋白免疫印迹(Westem blot) eIF4E siRNA转染H1299、A549细胞48h后提取细胞总蛋白，采用 蛋白免疫印迹方法检测eIF4E siRNA转染后eIF4E和Pim一1蛋白表达情况， 并计算其相对表达量。采用Oayssey仪器进行显色分析，Bio．LD图像分 析系统进行定量分析。 6 Real．．time PCR 转染处理H1 299和A549细胞48h后，应用Real．time PCR方法检测 细胞中Pim一1和eIF4E mRNA的表达情况。采用Applied Biosystems公司 提供的Comparative Ct(AACt)方法计算，计算目的基因的相对表达量。 7统计 应用SPSS Statisticsl7．0软件，数据分析采用两样本t检验、矛检验、 spearman等级相关分析及曲线拟合；计量资料以均数-4-标准差(x+SD) 表示。P0．05认为差异具有统计学意义。 结果： 1 eIF4E蛋白在NSCLC组织中的表达及