eb病毒潜伏膜蛋白1转化咽上皮细胞的磷酸化蛋白质组学研究-病理学与病理生理学专业毕业论文.docxVIP

硕士学位论文 硕士学位论文 中文摘要 pLNSX为对照)分别导入PA317包装细胞，G418筛选2周后扩大培 养，自细胞培养上清获得后续实验所需的感染性逆病毒RV-pLNSX、 RV-LMPlwr、RV-LⅧ1TRADD与RV-LMPl△232。51。然后，用浓缩的病 毒分别感染人鼻咽上皮细胞NP69，汇合克隆培养，获得 NP69．pLNSX NP69．LMP 1 NP69．L脚1吼∞D 与 wr NP69．L脚1必2。514种转化细胞系。观察和检测以上转化细胞的形态、 生长曲线、平板克隆、细胞周期等。同时，采用固相pH梯度双向凝 胶电泳技术结合Westem Blot方法分析NP69．pLNSX、NP69．LMPlwr、 NP69．L御1TRADD与NP69．LMPl△232。351细胞系磷酸化蛋白质表达的差 异，即在感染24小时后抽提细胞总蛋白，2-DE分别分离 NP69．pLNSX、NP69．LMP 1 wr、NP69．LⅧ1吼心D与NP69．LMP 1△232·35 1 细胞的总蛋白质，每组平行进行两块胶电泳，其中一块作为制备胶， 另一块作为分析胶。制备胶考染显色，得到了分辨率较高、重复性较 好的NP69．pLNSX、NP69．LMP 1 wr、NP69．LMP 1 T啪D与 NP69．LMPl△232。351细胞总蛋白质2．D胶电泳图谱；分析胶中的蛋白质 转移至硝酸纤维素膜后，与抗酪氨酸磷酸化抗体孵育，进行Westem Blot分析，获得差异表达酪氨酸磷酸化蛋白质的反应图谱；将制备胶 的电泳图谱和Westem Blot的反应图谱进行比对分析，在制备胶上找 到相应的差异酪氨酸磷酸化蛋白质点。利用MALDI—TOF．MS对差异 酪氨酸磷酸化蛋白质进行鉴定，部分差异蛋白质应用免疫沉淀方法进 行验证。 结果：(1)NP69．LMPl wT细胞在培养过程中，逐渐由多角形、 II 硕士学位论文 硕士学位论文 中文摘要 鹅卵石样典型上皮形态演变成细胞间接触减少的长梭状纤维细胞样 形态，而NP69．LⅧ1TRADD与NP69．LMPl4a32。351细胞呈近乎多角形， 比较接近NP69．pLNSX细胞形态；NP69．LMPlwr细胞的生长速度、S 期细胞所占比例Et,NP69．LⅧ1TRADD与NP69．LMPl△232。351及载体对照 组NP69．pLNSX细胞明显增加；(2)在NP69．pLNSX与NP69．LMPlwr 细胞比较组鉴定了12种差异表达的磷酸化蛋白质(上调有HSP27、 波形蛋白等，下调有膜联蛋白A1、GTP结合蛋白等)，在NP69．LMPlwr 与NP69．LⅧ1TRADD细胞比较组鉴定了11种差异表达的磷酸化蛋白 质，在NP69．LMPlwr与NP69．LMPlaz32。351细胞比较鉴定了10种差 异表达的磷酸化蛋白质。其中大部分是与细胞结构、信号传导和转录 翻译相关的蛋白；(3)在这些差异蛋白质中，有10种磷酸化蛋白质 体现了LMPl羧基端各功能区的特异性，如HSP27在NP69．LMPlwr 与NP69．LⅧ1TRADD细胞表达增加(与NP69．pLNSX细胞比较)，在 NP69．LMPl△232。351细胞却不增加等。(4)免疫沉淀验证了4种蛋白在 转化细胞蛋白磷酸化表达水平的差异，结果与蛋白质组学结果一致 结论：(1)LMPl可能通过上调HSP27、波形蛋白、角蛋白等， 下调膜联蛋白A1、GTP结合蛋白，分子伴侣TCPl等多种蛋白的磷 酸化促进NP69细胞转化。(2)CTAR2可能介导LMPl对波形蛋白， ER-60，HSP70等蛋白磷酸化的上调和膜联蛋白A1，磷脂酰乙醇胺结 合蛋白，蛋白酶体等蛋白磷酸化的下调而产生致瘤作用；(3)CTAR3 可能介导LMPl对ER．60，角蛋白8，HSP27等蛋白磷酸化的上调和 磷脂酰乙醇胺结合蛋白，蛋白酶体，膜联蛋白A2等蛋白磷酸化的下 111 硕士学位论文 硕士学位论文 中文摘要 调而产生致瘤作用。 关键词： EB病毒，LMPl， 鼻咽上皮， 转化， 磷酸化蛋白质组 IV 硕士学位论文 硕士学位论文 英文摘要 Abstract Background a