HBV抗原肽HLAA0201五聚体流式细胞技术检测慢性HBV感染患者特异性CD8T细胞.doc

HBV抗原肽-HLA-A0201五聚体流式细胞技术检测慢性HBV感染患者特异性CD8+T细胞 刘先进1吴月平1张红春2韩刚1沈张平2宋健辉2季沈杰2陈琳1 （1南通市第三人民医院226006； 2启东市人民医院江苏南通 226006） 】R的研宄不同临床感染状态慢性HBV患者外周血HBV特异性CD8+T 淋巴细胞（CTL）频率的变化及临床价值。方法采用HBcAgl8-27表位肽 -HLA-A*0201五聚体（MHCPentamers）及CD8单克隆抗体，设计流式细胞技术 检测外周血屮针对该肽段的特异性CTL数量，以占总计数CD84?细胞数的百分比 表示，同时对HLA-A2等位型进行鉴定。结果18例非HBV感染患者屮12例HLA-A2- （对照组）特异性CTL数为0.33%-3.90%,屮位数为1.04%。HLA-A2-的CHB、 LC、HLA-A2+的 CHB 特异性 CTL 数为分别为 0.25%-10.69%、屮位数 1.60%、n=24, 0.34%-12.20% 屮位数 1.85%、n = 13, 0.20%-29.90%中位数 1.41%、n = 24, 三者与对照组无显著差异。HLA-A2-的PHC、HLA-A2+的LC、PHC特异性CTL数分 别为 1.27%-20.30% 屮位数 6.69%、n=5, 0.14%-18.40% 屮位数 2.88%、n=18, 0.72%-39.22%、屮位数1.33°%、n=7,三者显著高于对照组。HLA-A2-抗病毒治 疗者特异性CTL数显著高于相应未抗病毒治疗者。HLA-A24?未抗病毒组屮血清 HBVDNAlt;103copies/mL、ALTlt;40IU/L 者特异性 CTL 频率有增高趋势。结论 HBV 抗原肽-HLA-A*0201五聚体流式细胞技术能在体外直接检测外周血HBV特异性 CTL频率的变化，其水平一定程度反映不同临床感染状态慢性HBV感染患者T淋 巴细胞对特异性抗原表位免疫应答的差异。 关键词】HLA-A2抗原MHC-五聚体CD8+T淋巴细胞流式细胞术 】R446 】A 】2095-1752 （2013） 24-0032-03 乙型肝炎病毒（HBV）病毒本身及其在体|Aj的复制并不引起肝细胞的损伤, 它的发病机制主要是机体清除HBV而引发的细胞免疫病理改变，而特异性细胞（T 辅助细胞、细胞毒性T细胞）免疫机制可能是乙型肝炎发病机制的中心环节；CTL 活化以及生物学效应都严格受HLA-I限制，不同HLA-I等位型个体可以有不冋的 抗原表位，研究抗原特异性CTL必须结合具体HLA-I等位型。我们采用的表位肽 是针对HLA-A*0201等位型个体（与HLA-A2相同），在四聚体基础上改进的五聚 体（MHC pentamers ）法结合流式细胞技术定量分析不同临床感炎状态慢性HBV 患者外周血抗原特异性CTL，探讨其临床应用价值。 1材料和方法 1.1研究对象91例慢性HBV感染患者中48例慢性乙肝（CHB）、31 例肝硬化（LC）、12例原发性肝癌（PHC）,诊断符合2000年第十次全国病毒性 肝炎及肝病学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准。所有患者均排除甲、丙、丁、 戊型肝炎病毒以及CMV、EB病毒、HIV感染，无自身免疫性疾病，无嗜洒史， 无肝毒性药物使用史，其中51例进行核苷类药物抗病毒治疗。以18例手足口病、 妊娠肝损害、洒精性肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎等非HBV感染者作对照。 1.2主要试剂及来源FITC结合鼠抗人HLA-A2单克隆抗体购自Serotec 公司。FITC结合的鼠抗人CD8单克隆抗体、溶血素购自BDPharmingen公司， HLA-A*0201限制HBV抗原表位肽-五聚体复合体（Pro5TM MHC Prenamers）购 自英国Proimmune公司，所含HBV抗原表位肽为HBcAg 18-27,序列为FLPSDFFPSV。 HBV血清标志物HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HbcAb检测试剂购自美国Abbott 公司，血清HBVDNA含量检测采用上海科华试剂，检测限103copies/ml。 1.3 HLA-A2等位型的鉴定采用流式细胞术，所有研究对象取100ul肝 素钠抗凝新鲜全血,加入检测管和对照管，分别加入HLA-A2单兑隆抗体及同型对 照10 ul,16-27°C,避光放置30 min,经溶血、FACS洗涤液洗涤,FACS固定液固定,4°C 保存，用于流式细胞仪检测，同吋每份标本均设阴性对照。 1.4五聚体和CD8染色所有研究对象分设双阴性对照管、五聚体阴性 和CD8阳性对照管、五聚体和CD8双阳性检测管，每管取新鲜肝素钠抗凝全血 100ul,加入lulMHC五聚体和10UICD8单克隆抗体以