抗vegf与il-10主动免疫对hpv感染肿瘤模型的作用及碳 氮源对酵母高密度发酵与不同启动子指导的hpv16 l1表是达的影响.docx

中国医学科学院北京协和医学院硕士论文 3．4．2透视电子显微镜观察病毒样颗粒 32 3．5重组蛋白Trx-ILlO进行western Blot鉴定与Q阴离子柱纯化 ．33 3．5．1 Western Blot鉴定重组蛋白Trx．ILIO 33 3．5．2重组蛋白Trx—ILIO进行Q-Sepharose FF阴离子柱纯化 ．34 3．6抗原肽与病毒样颗粒载体的化学偶联 ．35 3．7疫苗免疫对Tc．1移植小鼠肿瘤生长的干预 36 3．7．1疫苗免疫后特异抗体水平检测 36 3．7．2疫苗预防性免疫对小鼠肿瘤生长的影响 37 3．7．3肿瘤抗原特异细胞免疫应答 38 3．7．4血清中细胞因子表达水平 39 3．7．5应用流式细胞术检测细胞中Th2细胞增殖情况 40 3．7．6肿瘤组织石蜡切片经HE染色观察肿瘤血管生成 ．．42 第四章讨论 ．44 4．1靶向VEGF和lL_10的病毒样颗粒疫苗的构建 ．44 4．2靶向VEGF和|L-10的疫苗免疫的效果评价 ．45 4．3疫苗免疫抗肿瘤生长的效应机制评价 ．46 4．4小鼠肿瘤病理切片评价 ．47 第五章结论与展望 ．48 5．1结论 ．48 5．2展望 ．48 第二部分 碳、氮源对酵母高密度发酵及不同启动子指导的HPVl6 L1表达的影响 ． ．．5() 摘要 50 关键字 51 Abstract ． ． ． ．． ． ． ．． ． ． ．． ． ． ． ． ． ．5]【 Keywords ． ． ． ． ． ． ． ．． ．． ．． ． ． ． ． ．． ． ．．．52 第一章前言 ．53 1．1 HPV及其引起的疾病 一53 1．2 HPV相关疫苗的研究和发展 ．．53 1．3毕赤酵母表达系统 ．54 1．4毕赤酵母启动子研究进展 ．55 1．5本课题研究思路、目的及意义 ．55 1．5．1研究思路 ．．55 1．5．2研究目的 ．56 1．5．3研究意义 ．56 万方数据  中国医学科学院北京协和医学院硕士论文 第二章实验材料与方法 ．58 2．1实验材料 ．58 2．1．1质粒和菌株 ．58 2．1．2主要试剂 58 2．2主要仪器 ．58 2．3常用试剂配制 ．58 2．4实验方法 ．58 2．4．1种子液制备 ．58 2．4．2小型发酵罐(1．5L)的高密度发酵 58 2．4．3 0D枷的检测 59 2．4．4湿重检测 ．59 2．4．5 Western blot检测HPV 16L1蛋白的表达 ．．59 2．4．6软件分??蛋白表达水平及表达产量 ．59 2．4．7 HPVl6L1蛋白初步纯化 ．59 2．4．7．1溶液配制 59 2．4．7．2初步纯化 60 2,4．7．3电镜观察 60 第三章实验结果 ．61 3．1具PTEF／HPVl6 L1表达单元的毕赤酵母利用不同碳源生长增殖情况．．61 3．2不同碳源利用条件下PTEF指导的HPVl6一L1蛋白表达率动态分析 61 3．3不同碳源利用条件下P僻指导的HPVl6一L1蛋白总产量动态分析 63 3．4具PFLJHPVl6 L1表达单元的毕赤酵母利用不同碳氮源的生长增殖情况 ．6zI 3．5不同碳氮源组合下P，凹指导的HPVl6一L1蛋白表达率动态分析 64 3．6 不同碳氮源组合下P，凹指导的HPVl6一L1蛋白总产量动态分析 66 3．7 具P Aoxl／HPVl 6 L1表达单元的毕赤酵母菌体生长增殖情况 ．67 3．8 Western blot分析甲醇诱导毕赤酵母PAo×1指导的HPVl6一L1的表达67 3．9 毕赤酵母在PAoxl指导下利用甲醇诱导的HPVl6一L1蛋白的纯化 ．68 第四章讨论 ．70 4．1启动子PTEF指导下的HPVl6L1蛋白表达 ．70 4．2启动子PFLD指导下的HPVl6L1蛋白表达 ．71 4．3启动子PAOxl指导下的HPVl6L1蛋白的表达与纯化 71 4．4小结 ．72 第五章结论与展望 ．73 5．1结论 ．73 IV 万方数据  中国医学科学院北京协和医学院硕士论文 5．2展望 ．73 参考文献 75 附录 78 附录I英文缩写词 ．．78 附录II主要溶液的配制 ．．79 附录III主要试剂及耗材 ．．83 附录Ⅳ主要仪器 ．．84 致谢 86 作者简介 88 独创性声明 89 V 万方数据  中国医学科学院北京协和医学院硕士论文 第一部分 抗VEGF与IL-IO主动免疫对HPV感染肿瘤模型的作用 摘要 背景肿瘤免疫抑制微环境显著抑制抗肿瘤免疫，促进肿瘤的发生发展，并阻碍肿 瘤免疫治疗取得疗效。IL-IO是重要的免疫抑制分子，可显著抑制细胞毒T淋巴细胞 (CTLs)与Thl细