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用于光学显微镜观察的组织常规制片技术 ——历史沿革与理论基础 17 世纪中叶，原始光学显微镜的诞生给生物学研究带来了技术革命。首先得 益的是植物学家，因为多数植物组织比较坚韧，容易被锋利的刀片切成薄片；而 薄切片有利于光线穿透，是光镜观察的前提条件之一。此外，由于植物细胞较大 且具有细胞壁，因而轮廓明显；再加上某些色素的作用，使用光镜观察普通植物 组织变得非常便利。徒手切片—镜下直接观察成为早期显微镜研究的技术模式。 但是，动物组织要直接用显微镜观察却存在很多技术困难。首先，动物组织 多数比较柔软，难以徒手切成薄片；如果冻硬再切，由于冰晶体和细胞内外渗透 压的变化，组织在冰冻过程中形态和化学组成会遭到破坏。其次，动物细胞没有 细胞壁，而细胞膜在光镜下不易分辨，故细胞轮廓不清，即使组织能够切成薄片， 成像质量也很差。另外，动物机体死亡后，组织自溶的速度很快，操作过程中也 会发生不利于观察的变化。 为了解决动物组织显微镜观察的技术困难，科学家不断尝试，终于在 19 世 纪上半叶找到了第一个解决方法：用酒精或甲醛溶液处理组织标本。新鲜的动物 组织标本浸泡在酒精或甲醛溶液中一段时间后，标本变硬了。由于组织的硬化， 徒手切片成为可能。此外，人们很快发现酒精和甲醛这类液体的另一个更加有意 义的作用：标本浸泡在其中就不会发生自溶或者腐败。由于这个特性，人们把组 织经过这类液体处理的过程称为“组织固定” （Fixation ），酒精或甲醛则成为经典 的“ 固定液” （Fixative ）。后来，又发现了很多种固定液，比如重铬酸钾、氯化汞、 醋酸和锇酸等等，并逐渐开始将某些液体混合使用以弥补单一固定液的不足。 虽然组织保存和操作的难题攻克了，但动物组织在光镜下呈半透明状而难以 分辨的问题仍然没有解决。于是人们想到了用传统染料着染组织。经过摸索和改 进，科学家找到了又一个解决方法。一种从巴西苏木的树干心材中提取的天然染 料— 苏木精（Hoematoxylin ）脱颖而出。用苏木精浸染组织切片后，细胞核变成 蓝色，在光学显微镜下非常鲜明；而且细胞膜的位置也能着染成很淡的蓝色，使 整个组织的结构和轮廓清晰可辨。后来，人工合成的染料伊红（Eosin ）问世后， 人们能将细胞质等成分染成红色，使镜下组织结构的对比度进一步加大，此即苏 木素-伊红（HE ）染色法。与此同时，结晶紫、苯胺兰、天青和胭脂红等染料也 纷纷用于切片染色。因此，到 19 世纪中叶，组织固定—染色—徒手切片成为了 当时流行的技术模式。 19 世纪下半叶，两个重要的技术改进使生物组织制片工作的效率和质量产生 1 了巨大飞跃。首先是波希米亚（今天的捷克）科学家浦肯野率先采用机械切片取 代徒手切片。这一改进，使切片变得更薄，厚度也更均一。时至今日，沿袭着最 早的机械切片思路，切片机（Microtome ）的种类和功能已经得到了充分的发展， 如轮转式切片机、滑行切片机、冰冻切片机等等。除此以外，浦肯野还发明了用 树胶封存切片的办法，解决了染色结果保存的问题。第二个重要的技术改进就是 采用组织包埋法（Embedding ）。固定后的组织标本虽然有所硬化，可以徒手切 片，但如果用精密的机械进行切片操作却仍然显得太软；此外，需要长期研究的 标本如果一直浸泡在固定液中，会发生不利的化学变化。针对这些问题，19 世 纪末一篇不太起眼的技术报告宣告了石蜡包埋法的诞生。石蜡包埋法的原理是： 由于石蜡与水不相溶，因此用一种“脱水剂” （dehydrating agent ）将组织内的水分 置换掉；这种脱水剂需要满足的条件是既要能溶于水又要能溶解石蜡；然后用加 热熔化的石蜡浸泡组织，于是石蜡又将组织内的脱水剂置换掉，充分填充组织， 冷凝后形成石蜡包埋的组织块。这样的包埋组织块有足够的硬度，机械切片的厚 度能够下降到1~2 微米，而且标本可以保存多年不变质。石蜡切片在染色前需要 经过与包埋相反的程序脱去石蜡，才能够与染料充分反应。 由于以上技术改进，20 世纪初时，用于光学显微镜观察的组织制片工作已经 形成了组织固定—包埋—切片— 染色— 封固这一技术模式。该模式一直沿用至 今，构成现代组织学和病理组织学实验观察的基础。其中，石蜡切片—HE 染色 已经成为最常规的技术，广泛应用于医学教学、临床诊断和组织学研究。该技术 显示结构精细连贯、成像清晰，染色结果可靠且耐保存。以下简单总结石蜡切片 —HE 染色的基本技术步