试验技术服务标本取材要求.doc

标本取材要求 一．RT-PCR、定量PCR、Western Blot样本取材要求： （一）新鲜组织 1．操作时带手套、口罩、帽子（须无菌操作，避免样本污染）。 2．取材器械事先进行高压灭菌，尽量做到无RNA酶，取材时有条件再用酒精灯火焰消毒。 3．取材时间尽可能短（在5分钟内取好一个样本，有血迹可用PBS液或生理盐水冲洗后放入冷冻管中或进口的Eppendorf管，然后再放入液氮中）。 4．组织大小：至少100mg。 （二）血液 1．取血1-2毫升，放入加有4%EDTA-2Na抗凝剂管子中（每1ml血液中加30ul抗凝剂），混匀。 2．加3倍体积的红细胞裂解液，室温放置5分钟，间或混匀1次，10000转/分离心1分钟（或2000转/分15分钟），去掉上清。 3．沉淀中加1毫升Trizol，振动混匀，冻在-80℃冰箱，送出时用冰块保存。 （三）细胞 1．细胞数目至少1*107。 2．贴壁的细胞用胰酶消化下来，1500转/分离心5分钟去掉上清。冻在-80℃冰箱，送出时用液氮保存。. 二．原位杂交标本取材要求： 1．操作时带手套、口罩、帽子（须无菌操作，避免样本污染）。 2．取材器械事先进行高压灭菌，尽量做到无RNA酶，取材时有条件再用酒精灯火焰消毒。 3．必须用0.1%DEPC处理的无酶水（即将配好的0.1%DEPC水放置12小时后高压灭菌30分钟）配多聚甲醛固定液 4．取材时间尽可能短（在5分钟内取好一个样本，有血迹可用PBS液或生理盐水冲洗后直接放入多聚甲醛中固定，固定液约为标本体积的10倍）。 5．固定好的标本应尽快送到检测的实验室，进行脱水、包埋处理。 三．（免疫）电镜标本取材要求： （一）透射电镜 1．组织标本：在固定液中切成10*10*5mm大小的组织块，立即放入5%戊二醛（4度冰箱中拿出）固定，固定液约为标本体积的10倍，六小时内立即送检，若来不及送检，可将固定好的样本放在4度冷藏（不可用液氮保存，以防冰晶）。 2．细胞取材要求：细胞培养贴壁，细胞数至少为106，用胰酶消化后，低速2000-3000r/min离心5分钟，去除上清，用5%戊二醛（4度冰箱中拿出）固定，放入冰袋里送检，若来不及可放4。C冰箱保存 （二）扫描电镜 1．组织标本：在固定液中对组织进行修块，立即放入2.5%戊二醛（4度冰箱中拿出）固定，固定液约为标本体积的10倍，六小时内立即送检，若来不及送检，可将固定好的样本放在4度冰箱冷藏（不可用液氮保存，以防冰晶）。 2．细胞爬片：把培养液轻轻倒掉，用PBS小心清洗2次，注意不要把细胞碰掉，放到2.5%的戊二醛固定液（4度冰箱中拿出）中，固定液要没过爬片一倍体积以上，放在4度冰箱中，可以存放一周到2周，样本送出检测时，放点冰块，保持较低温度，避免细胞形态变形。 四．免疫组化标本、细胞凋亡TUNEL法标本取材要求： （一）组织 1．固定液：10%福尔马林液或4%多聚甲醛缓冲液；固定液体积为组织块的10倍以上； 2．取材保持组织新鲜（组织块以小于2cm*1.5cm*0.3cm为宜），立即放入固定液中，避免干燥，常温保存。 （二）细胞爬片 1．细胞培养成爬片 2．用10%福尔马林或4%多聚甲醛，固定20分钟 3．用酒精脱水，85%乙醇，到95%乙醇，再到100%乙醇，固定1-2分钟，放在-20℃冰箱保存 4．用中性树脂封在玻片上，细胞面朝上，干燥送出。 （三）血液样本 1．肝素抗凝（25ul/ml）外周血1－2ml。 2．用PBS稀释一倍，缓缓沿管壁加于含有等量淋巴细胞分离液的10ml离心管上层，使两种溶液之间界限分明。 3．用平转离心机离心15－20分钟（2000转/分）。 4．吸取血浆和分离液交界面白色云雾状单个核细胞层于另一个10ml离心管中，加PBS到10ml，离心5－10分钟（1000转/分）。 5．倾去上清液，轻轻弹起细胞沉淀，再加10mlPBS，离心5－10分钟（1000转/分）。 6．尽量去掉上清液，利用余下的少量液体（约50－100ul）将沉淀细胞混悬。 7．取细胞悬液涂滴于玻片（用特种笔划一个圆圈，范围4－5mm），使细胞单个分散，室温下吹干或37℃烘干。（涂片应彻底干燥以确保细胞更牢固地粘贴于玻片上。） 8．涂片凉干后用丙酮（-20℃）固定30min，放在切片盒内，保持干燥，4℃保存即可。 五．酶免、生化标本取材要求 1．血清 室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，放入E管中，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。样本保存在-20℃冰箱里，可以保存2-3个月。 2．血浆 应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸纳或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收