生物化学化与分子生物学实验技术2.ppt

（三)放射性核素的防护 放射卫生防护条例规定，放射性核素可分为极毒、高毒、中毒和低毒四类。131I属于高毒类，32P、35S为中毒，而3H和14C则属于低毒类。因此 在进行放射性核素操作时决不能掉以轻心，否则有可能造成严重的人身伤害和环境污染。 (1)工作场所：核素操作应在专用的核素室内进行。核素工作实验室应分为清洁区、中间区( 缓冲室)和活性区三部分。室内墙壁、天花板、地面应光滑无缝、不透水。室内应有良好的通风设备。放射性污水应有专用的下水系统，水龙头开关最好采用长臂式或脚踏式。 (2)个人防护：进行核素操作应穿戴专用的工作服、工作帽、防护手套、口罩、防护鞋及防护眼镜。尽量在有机玻璃防护屏后进行操作。操作台上应铺有吸水纸。操作结束后要及时清 理用具，并用盖革管对工作台、器械及身体进行探测，确保无污染。长期进行核素操作的工作人员应定期进行体检及化验检查。孕妇严禁进行核素操作。 (3)废物处理：放射性核素废物必须贮存在专门的容器内，并用铅玻璃屏障。容器上必须有 标签，注明核素种类、剂量及使用日期。对于32P等半衰期小于15天的放射性废物可 采用放置法处理，即放置约10个半衰期的时间，然后倒入下水道或按一般废物处理。半衰期长的应集中收集交由专门单位再进行焚化法或掩埋法处理。 (4)意外事故的处理：少量放射性物质污染工作台或地面，应立即用吸水材料吸干，然后再用清水反复擦洗，但应注意不要使污染面积扩大，直到放射性接近本底。如污染严重，则经 初步控制污染后，应暂时封闭现场。放射性物质污染皮肤时，应立即用吸水纸吸去污物，然后用软毛刷和肥皂反复刷洗，直到放射性接近本底，刷洗过程中也应注意不要使污染范围扩大，切不可擦破皮肤。如误服放射性物质，应立即进行嗽口、洗胃和催吐等方法处理，以促使其在未吸收前排出体外，另外应根据不同的放射性核素选择不同的促排剂以加速已吸收的放射性物质排出体外。 (四)非放射性标记物的选择 根据其检测方法：非同位素标记物可分为以下几类： (1) 半抗原：目前使用较多的非放射性标记物是生物素和地高辛，它们都是半抗原，可以利用这些半抗原的抗体进行免疫检测。 (2) 配体：生物素还是一种抗生物素蛋白(卵白素，avidin)和链霉菌类抗生物素蛋白(strep tavidine)的配体，可以利用亲和法进行检测。 (3) 荧光素：如FITC、罗丹明类等，可以被紫外线激发出荧光进行观察，主要适用于细胞原位杂交。 (4) 化学发光：一些标记物可与另一物质反应而产生化学发光现象，可以象放射性核素一样直接对X-光胶片进行曝光，这类标记物可能是今后研究的主流。 (5) 光密度或电子密度标记物：如金、银等，适用于细胞原位杂交，可在光镜下或电镜下进行观察。 三、探针的放射性核素标记 1.切口平移法 线状、超螺旋及带缺口的环状双链DNA均可作为切口平移法的模板。 首先，极微量的DNase I在Mg2+的存在下，在DNA链上随机形成单链切口。利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性在切口处将旧链从5′末端逐步切除。同时，在DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶活性的催化下，在切口的3′末端-OH上合成新的DNA单链。如果在反应液中含有一种或多种标记的核苷酸(如32P-dCTP)，则这些标记的核苷酸将 替代原来的核苷酸残基，从而形成高放射活性的DNA探针。 2.随机引物法 随机引物是含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物，可以与任意序列的核酸杂交，形成DNA聚合酶的引物，目前市售的随机引物为6个核苷酸残基的各种可能排列顺序共46=4090种。将变性后的模板DNA与随机引物混合复性，在大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)催化下合成新链，反应液中有［α-32P］-dNTP时，即可形成放射性核素标记的DNA探针。加入的随机引物越多，探针合成的起点越多，得到的探针会越短。 3.末端标记法 利用T4DNA聚合酶，T4多核苷酸激酶、KlenowDNA聚合酶、末端转移酶等可以标记探针的一端，标记活性较切口平移法和随机引物法低得多，一般很少用作分子杂交的探针，主要用 于DNA序列测定，故不作详细介绍。 4.探针的纯化 探针标记后，有时需要用凝胶过滤法除去未掺入的dNTP等小分子，收集含探针的第1锋，有时还需用酒精沉淀探针。 四、探针的非放射性标记 按照标记方法的不同，现有的非放射性标记物主要有两种类型，一种是预先已连接在NTP或dNTP上，因此可象放射性核素标记的核苷酸一样用酶促聚合方法掺入到核酸探针上，如生物素、地高辛等。另一类是直接与核酸进行化学反应而连接在