生物化学技等术实验.pptVIP

1、? 以鸡蛋清为原料经过提取、分离、纯化等手段得到一个纯度较高的胰蛋白酶的天然抑制剂鸡卵类粘蛋白（简称CHOM），以猪胰脏为原料经过提取、分离、激活等步骤得到胰蛋白酶的粗提液。并且对所得到的鸡卵类粘蛋白和猪胰蛋白酶的含量、纯度及其生物活性进行测定。2、以SEPHAROSE 4B为载体经过活化，偶联合成一个具有专一性的特殊配基--卵类粘蛋白作为亲和吸附剂。3、 用自己合成的亲和吸附剂，通过亲和层析技术得到非常纯的猪胰蛋白酶。 实验内容提要 实验流程 1. 鸡卵类粘蛋白的制备 ?鸡卵类粘蛋白粗品的制备 ?鸡卵类粘蛋白粗品的精制 2.亲和吸附剂的合成 载体的活化 ???? 配体与载体的偶联 亲和吸附剂的装柱 3. 猪胰蛋白酶粗提液的制备及酶的精制 ??猪胰蛋白酶原的提取 ?? 胰蛋白酶原的激活 上亲和层析柱纯化 三大任务 ! 做明白人，干明白事。先动脑，再动手。！实验无小事，事事不马虎。! 实验结果和数据及时保存及处理! 保持实验室整洁。。。。。 N项注意 *胰蛋白酶标准品的比活力（BAEE单位/mg蛋白） *鸡卵类粘蛋白粗品和纯品的抑制比活力（BAEE单位/mg蛋白） *胰蛋白酶粗提液及纯品的比活力（BAEE单位/mg蛋白） *.鸡卵类粘蛋白产率(mg/100ml): 100ml鸡蛋清得到鸡卵类粘蛋白的mg数。 *.偶联率(mg/g): 1g Sepharose 4B偶联鸡卵类粘蛋白的mg数。 *.亲和吸附率(mg/g): 1g Sepharose 4B结合胰蛋白酶的mg数。 *.活性回收率: 经亲和层析后的胰蛋白酶总活性除以上样胰蛋白酶总活性。 *.纯化倍数: 亲和层析纯化的胰蛋白酶比活性与上样前的比活性之比。 需要得到的结果 *Sephadex G-25柱层析鸡卵类粘蛋白脱盐的层析图 *DE-32纤维素离子交换柱层析分离鸡卵类粘蛋白的层析图 * 绘制亲和层析分离胰蛋白酶的层析图 操作步骤 等电聚焦法 2、离子交换层析法 基质：纤维素、交联葡聚糖、树脂 电荷基团： 阳离子交换剂 （四） 配体亲和力的差异 ： 亲和层析 利用生物大分子能和其配体（例： 酶和抑制剂，抗原和抗体，激素和受体）通过次级键专一性结合，而在一定的条件下又可解离的原理进行层析的方法。 用这种层析方法，一次可将物质提得很纯，是一种专门用于分离生物大分子的层析方法。 ■ 亲和层析作用机理： (1) (2) (3) A B Sample Washing Elution X B 配体 X B A A 亲和吸附剂的制备 分离纯化一定数量的游离配体 载体活化 配体与载体偶联 Activity ■ 亲和层析图谱： Elution volume Protein pH 2.05 * （五）HPLC（high performance/pressure liquid chromatography) HPLC的特点： 1.支持介质颗粒细，比表面积大。 2.溶剂系统采取高压，洗脱速度增大。 HPLC是一项快速、灵敏、高效的分离技术。 纯化方案的评价 比活力： 活力单位数/mg蛋白 纯化倍数： 每步的比活力/粗抽提液的比活力 回收率： 每步的总活力 / 粗提液的总活力 ×100% 亲和层析纯化胰蛋白酶 手脑并用，知行合一 胰蛋白酶的制备 目前工业上提取胰蛋白酶主要有二种途径： 1、从动物胰脏中直接提取。 2、从猪胰残渣中提取。 胰蛋白酶的性质 胰蛋白酶在pH3.0时最为稳定，低于此pH时酶易变性； 当高于pH5.0以上时，酶易自溶而会失去活性。 提取制备胰蛋白酶的全部过程中应注意溶液的pH值以及在冷室（0一5℃）中进行操作为宜。 胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。 胰蛋白酶原先正常生理条件下，可以被肠激酶、钙离子所激活或自我活化成为有活力的酶。 猪胰蛋白酶原分子量为24-25kDa之间，而猪胰蛋白酶原激活后，N-端丢失－个6肽，分子量变为23.4kDa，分子构象发生了一定的改变，pI变为10.8。 胰蛋白酶对R1=Arg和Lys肽键具有选择性水解作用，将蛋白质水解为多肽或氨基酸。 -HN-CH-CO-NH-CH-CO- R1 R2 由于血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂，使胰蛋白酶不会消化正常组织。 在胰脏、鸡蛋清和大豆中，都含有相当量的胰蛋白酶抑制剂。 胰蛋白酶不仅能够水解Arg和Lys羧基所组成的肽键，而且也能水解酰胺键和酯