动物生物化学实验二.doc

实用标准文案 精彩文档 实验二 电泳技术 教学目的与要求：掌握常用的生物化学电泳技术，了解电泳中的注意事项。 教学重点与难点：电泳系统的构建及注意事项。 教学方法与手段：讲授和学生动手操作。 学时安排：2学时 教学内容： 一、引言 生物大分子如蛋白质，核酸，多糖等大多都有阳离子和阴离子基团，称为两性离子。常以颗粒分散在溶液中，它们的静电荷取决于介质的H+浓度或与其他大分子的相互作用。在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电的符号，这种迁移现象即所谓电泳。 二、实验目的、任务及原理 实验目的：掌握电泳技术方法及注意事项。 实验任务：学会醋酸纤维素薄膜电泳的使用方法。 实验原理：醋酸纤维素薄膜电泳（cellulose acetate membrance electrophoresis）以醋酸纤维薄膜为支持物。醋酸纤维素素薄膜是由二乙酸纤维素加工制成，具有均一的泡沫结构，厚度仅120um。醋酸纤维素素薄膜作为是电泳支持体有以下优点： ①电泳后区带界限清晰； ②通电时间较短（二十分钟至一小时）； ③它对各种蛋白质（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象； ④对染料也没有吸附。 作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少、应用范围广、分离清晰、没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白和同功酶的分离以及免疫电泳中。 例如，以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为α1—，α2—，β—，及γ—球蛋白。这些区带经洗脱后可用分光光度计法定量，也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。临床医学常利用它们间相对百分比的改变或异常区带的出现作为临床鉴别诊断的依据。此法由于操作简单、快速、分辨率高及重复性好等优点。目前，以成为临床生化检验的常规操作之一。 三、实验的拓展(由本实验的完成深化和延伸所学的知识，启发学生利用现有的设备拓展出新的实验内容,培养学生的创新思维和创新能力。) 醋酸纤维素薄膜电泳→支持物→纸、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶→电泳适用范围。 四、介绍主要仪器设备与使用 （1）新鲜血清（制备时要无溶血现象） （2）电极缓冲液：巴比妥-巴比妥钠缓冲液（）pH8.6,0.075mol/L，离子强度0.06）：分别称取巴比妥1.66g和巴比妥钠12.76g，合并后用蒸馏水溶解并定容至1000ml。 （3）染色液：称取氨基黑10B0.5g，分别加入蒸馏水40ml、甲醇50ml、冰醋酸10ml，混匀后，贮存于试剂瓶中。 （4）漂洗液：分别量取95%乙醇45ml、冰醋酸5ml和蒸馏水50ml，混匀即可。 （5）透明液： 甲液：分别取冰醋酸15ml和无水乙醇85ml，将二者混匀即可。 乙液：分别取冰醋酸25ml和无水乙醇75ml，将二者混匀即可。 （6）0.4mol/LNaOH溶液：称取16gNaOH，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。 （7）镊子（竹夹），醋酸纤维素薄膜（厚度约为120um），滤纸，铅笔与直尺，点样器或毛细管，电泳仪与水平电泳槽，分光光度计。 电泳槽是电泳系统的核心部分，根据电泳的原理，电泳支持物都是放在两个缓冲液之间，电场通过电泳支持物连接两个缓冲液，不同电泳采用不同的电泳槽。 电源：要使荷电的生物大分子在电场中泳动，必须加电场，且电泳的分辨率和电泳速度与电泳时的电参数密切相关。不同的电泳技术需要不同的电压，电流和功率范围，所以选择电源主要根据电泳技术的需要。 五、强调实验中要注意的问题 1、醋酸纤维素薄膜的预处理 市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片漂浮于电极缓冲液表面，其目的是选择膜片厚薄及均匀度，如漂浮15s—30s时，膜片吸水不均匀，则有白斑点或条纹，这提示膜片厚薄不匀，应舍去不用，以免造成电泳后区带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。由于醋酸纤维薄膜亲水性比纸小，浸泡30min以上是保证膜片上有一定量的缓冲液，并使其恢复到原来多孔的网状结构。最好是让漂浮于缓冲液的薄膜吸满缓冲液后自然下沉，这样可将膜片上聚集的小气泡赶着走。点样时，应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜。为防止指纹感染，取膜时，应戴指套或用镊子。 2、缓冲液的选择 醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥溶液，其浓度为0.05mol/L—0.09mol/L。选择何种浓度与样品及薄膜的薄厚有关。选择时，先初步定下某一浓度，如电泳槽两极之间的膜长度为8 cm—10cm，则需电压25V/cm