液体内沉淀试验.pptVIP

第六章 沉淀反应 第一节 沉淀反应的特点 第二节　液体内沉淀试验 一、絮状沉淀试验 二、免疫浊度测定 第三节　凝胶内沉淀试验 一、单向扩散试验 二、双向扩散试验 第四节 免疫电泳技术 一、对流免疫电泳 二、火箭免疫电泳 三、免疫电泳 四、免疫固定电泳 第一节 沉淀反应原理及特点 第二节　液体内沉淀试验 表6-1 最适比方阵测定法 当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度的改变。利用现代光学测量仪器与自动化检测分析相结合对浊度进行测定从而检测微量抗原或抗体。 1.抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量 高剂量钩状反应(high dose hook effect)：当抗原过剩时，形成的IC分子小，而且容易离解，浊度反而下降。 用抗体检测抗原，当反应液中抗体过量时，在一定范围内，IC的形成量与抗原量的递增正比，当抗原量递增至抗原抗体最佳比例时，IC的形成到达高峰。如再增加抗原量，IC的形成量反而减少。因此，如检测时抗原过量则得出错误的检测结果。 反应体系中保持抗体过量。 2.抗体的质量 ：特异性强，效价高，亲和力　　　　　　　强并使用R型抗体(等价带宽) 3.抗原抗体反应液的最适PH为6.5～8.5 4.使用增浊剂 1.透射免疫比浊法 2.散射免疫比浊法 3.免疫胶乳比浊法 第三节　凝胶内沉淀试验 可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。 要求：1、单价特异性抗血清（是指血清只与其特异性抗原发生反应）； 2、标准品； 3、灵敏度1.25μg/ml 影响因素： 抗体质量 标准曲线 ，质控血清 结果与真实含量不符 　单克隆抗体+多态性抗原=假性降低； 多克隆抗体+单克隆病=假性升高； 双环现象 　抗原性相同、扩散率不同的两个组分：α重链病人血清中的α重链与正常IgA 第四节　免疫电泳技术 优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度（μg/ml）。 　　3.增加了分辨率。 　　　 结果分析： 无沉淀线出现则表明无相应的抗原。 沉淀线位于抗原抗体孔中间，说明两者比例较适合。 沉淀线偏向抗原孔一方，表示抗体浓度＞抗原，反之，则是抗体浓度＜抗原浓度。 1.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则。 2.电泳终点时间的确定（云雾状、圆形→火箭窄峰）。3.标本数量多时应先通电后加样,防止宽底峰形. 4.IgG定量时，可用甲醛与IgG上的氨基结合（甲酰化），只带负电荷，抵消了电渗作用。 分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析。 1.主要用于血液、体液中蛋白质的测定。 2.优点：稳定性好，敏感度高，精确度高，简便快速，易于自动化，无放射性核素污染，适合大批量标本检测。3.对流免疫电泳与火箭免疫电泳技术由于电渗的缘故已不推荐使用。 4.免疫电泳扩散时间长，影响因素多，结果不易分析。 5.免疫固定电泳分辨力强，敏感度高，结果易于分析，常用于M蛋白的鉴定与分型。 沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出的沉淀现象.根据沉淀反应介质和检测方法的不同，将其分为液体内沉淀试验、凝胶内沉淀试验和凝胶免疫电泳试验三大基本类型。 免疫浊法度测定为液体内沉淀试验；单向扩散试验平板法是一种定量的凝胶内沉淀试验，免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物，常见的有对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫电泳、免疫固定电泳等。 1.什么是沉淀反应？ 2.沉淀反应的特点？ 3.免疫浊度法的原理、方法与分类？ 4.单向扩散试验的原理和应用？ 5.免疫固定电泳的原理及临床应用价值？ 6.何谓Mancini曲线？ 7.何谓Fahey曲线？ 8.影响免疫比浊测定的因素有哪些？ 9.抗原性质分析出现哪三种结果现象？结果解释？ 10.自动化免疫比浊法发展趋势和应用前景？ 电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关。 原理 单向免疫扩散＋电泳,定量检测技术 二、火箭免疫电泳 1.2%巴比妥琼脂糖约55℃，加入适量抗血清，混匀后制板，打孔，孔内加待测样品，样品孔放负极侧， 6h后观察琼脂板上沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓度。 技术要点 火箭免疫电泳 　　　　火箭免疫电泳图 ①②③④为标准抗原；⑤⑥为标本 - + 火箭免疫电泳示意图