参附注射液预处理对大鼠局灶性脑缺血2f再灌注损伤后脑水肿和AQP4的影响.pdfVIP

凼苤直匡堂陵亟±班塞生堂焦迨塞f2Q!Q生2 。 注射液的脑保护作用机制o 1材料和方法 1．1主要实验材料 ． 1．1．1仪器设备 0．26ram渔线 日本产 Olympus光学显微镜 日本Olympus光学工业株式会社 DTK一1000振动切片机 日本Doska(堂阪)EM株式会社 低温恒冷箱切片机 美国IECMinotome公司 QWin550CW图像信号采集分析系统德国．Leica公司 显微手术器械包 上海 1．1．2药品及试剂 参附注射液 四川雅安三九药业有限公司 氯化三苯四唑氮(2，3，5一Triphenyl美国Sigma公司 tetrazolium cMoride，TrC) 兔抗大鼠AQP4抗体 美国Chemico公司 免疫组织化学试剂盒(ENVISION)福州迈新生物科技有限公司 DAB显色试剂盒 福州迈新生物科技有限公司 三甲基氨基甲烷(Tris) Sigma公司 0．01M枸橼酸钠 福州迈新生物科技有限公司 Triton—X100(分析纯) 美国Sigma公司 大学医学院实验动物中心提供。随机分为4组：正常对照组(A组)、假手术组(B组)、缺 血再灌注损伤组(C组)、参附注射液预处理组(D组)o 1．3大鼠局灶性脑缺血／再灌注模型的制备参照马贤德等【91方法建立大脑中动脉阻 塞模型o 10％水合氯醛(400mg／kg)腹腔注射麻醉后，大鼠颈正中切开，分离右侧颈总动 脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎并剪断颈外动脉主干以备用。动脉夹暂时阻断颈内动脉远 心端、颈总动脉近心端，于近分叉处的颈外动脉插入涂有硅胶的渔线(直径约0．26ram)， 渔线拔出，恢复大脑中动脉灌注。扎紧切口、松开动脉夹并缝合皮肤(见图1)。假手术 组大鼠手术操作相同，渔线仅置入约1．0cm。术后注意大鼠维持体温。模型成功的标志 O 囱鏊直匡堂医亟±堑窒生堂焦迨塞f兰Q!Q生! 是动物麻醉苏醒后出现缺血对侧以前肢为重的偏瘫。模型纳入标准为神经症状评分在1 始部略为扩张并无血管内血栓形成或出血。 图1 模型插线路径示意图 A、B、C组用等量生理盐水替代。 无症状；1分：提尾时损伤对侧前肢不能伸直；2分：行走时向损伤对侧旋转；3分：行走时 向损伤对侧倾倒；4分：无自发活动或死亡。 1．6脑梗死灶体积和缺血侧脑组织水肿的测定用振荡切片机将鼠大脑自前脑额极 tool 10％甲醛溶液固定24h后，按切片顺序排列，经数码照像后数据输入计算机，用Image 3．0软件作图像分析。TIC染色呈红色为正常脑组织，白色区域为坏死组织。每一脑片 和梗死灶体积占全脑体积的百分比(％)二种方式表示；脑水肿百分率≈(∑RT一∑LT) ÷(∑RT+ELT)×100％[131，RT：每一脑片右半侧总面积。 1．7尼氏染色及免疫组织化学染色检测AQP的表达大鼠深麻醉后断头取脑，冠状 凼蓥直匡堂陵亟±婴塞生堂焦迨塞(圣Q!Q生2 e 位切取前囟及其后约0．6mm处的脑组织行快速冰冻连续切片，片厚lOum，用于尼氏染 色及免疫组织化学染色。免疫组化采用ENVISION二步法，切片在室温下放置15分钟 PBS中漂洗5rrtinx2次，2％正常山羊血清封闭、室温孵育30min，甩于，一抗4。C过夜(兔 水冲洗，苏木素复染、蓝化、梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。空白对照切片以 PBS液代替一抗，余操作同前。 1．8结果分析和统计学处理采用QWin