血清学诊等断技术.ppt

 三 器材 1.血凝板、 2.微量移液器 3.标准抗原 4.1%红细胞悬浮液 5.被检血清 6.稀释液 3. 红细胞悬液的配制： 将血液注入离心管中，经3000转/分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的细胞加稀释液（生理盐水）洗涤，再用离心机3000转/分钟离心5-10分钟，充去上清液，再加稀释液洗涤， 如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞，按1%的稀释度加入稀释液（1毫升红细胞泥加99毫升稀释液）。 (二)．被检血清 将被检鸡群编号登记，用消毒过的干燥注射器采血，注入洁净干燥试管内（微量法可用孔经2-3毫米塑料管由翅静脉采血），在室温中静置或离心，待血清析出后使用。 注意: 每只鸡应更换一个注射器，严禁交叉使用。 2.抗原血凝价的测定 每种抗原做两排，结果取均值 1). 1-12孔加生理盐水25ul 2). 第1孔加抗原25ul，反复吹打10次吸取25ul到第2孔，依此类推倍比稀释至第11孔 3). 最后从第11孔吸取25ul弃去,第12孔做生理盐水对照 4). 所有孔加25ul 1％红细胞 5). 将血凝板振荡1分钟 注意 能使鸡红细胞完全凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。如上例，病毒病的HA效价为1：320。 鸡新城疫红细胞凝集抑制试验（HＩ试验） (过程图) 琼脂免疫扩散试验（AGP） 一 原理 抗原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶中,可以向四周扩散,当抗原抗体扩散到适当比列处相结合,出现肉眼可见的沉淀线. 常用已知抗原检测相应的抗体 血 清 平 板 凝 集 试 验 （二）试验过程  1. 取抗原液25ul滴于载玻片上 2 . 迅速在抗原液上滴加等量的被检血清 3. 快速用牙签将血清与抗原混匀 4. ? 并涂布成 2cm大小的片状 5.? 在灯箱附近不断晃动玻片2分钟，观察有无凝集 新城疫病毒、禽流感病毒的分离和鉴定 （二） 脑内致病指数（IICP） 1、取凝集价在24以上的新鲜感染尿囊液 用生理盐水10倍稀释； 2、脑内接种1日龄雏鸡（24-40小时） 10只， 每只0.05ml； 3、 每24小时观察一次，共观察8天； 4、 每天观察给鸡打分，正常鸡为0分； 病鸡为1分；死鸡为2分；鸡每天观察仍记录2分） IICP是每只鸡8天所有观察数值的平均数强毒力病毒ICPI为2，温和毒数为0 ?(三） 静脉致病指数（IVPI） 1 将HA高于24的新鲜感染尿囊液 用生理盐水做10倍稀释 2 给10只6周龄SPF鸡静脉接种0.1ml 3 每天观察一次，共10天，每次观察记录正常鸡为0，病鸡1， 瘫痪鸡、有神经症状者为2， 死鸡记作3（死鸡以后每天仍记3） IVPI指每只鸡10天内观察值的平均数， 温和型和中等毒力者IVPI为0，强毒株为3 禽脑脊髓炎病毒的分离和鉴定 一 采样 （一） 取发病典型的雏鸡脑组织 （发病早期，不超过2—3天） 加含双抗的生理盐水制成10—20％悬液 （二） 4℃作用2—4小时， （三） 1500转离心30分钟，取上清液备用。 ? 二 鸡胚接种 1 取5-7日龄SPF鸡胚5-10枚 2 卵黄接种 将鸡胚垂直放于蛋托上 3 在气室中央打孔， 用7#针头垂直插入剩下1cm左右 4 接种0.2ml病毒液，封蜡 5?? 37℃继续孵化11天—12天，观察结果 三 结果判定 1 自然感染的野毒不易使SPF鸡胚出现病变 需要传3—4代才能适应鸡胚出现病变 . 2 取半数鸡胚打开观察鸡胚观察 肌肉营养不良，腿肌运动性降低 脚趾弯曲等变化 3 另一半鸡胚继续孵化 出壳后