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激光扫描共聚焦显微镜 南京医科大学 Carl Zeiss LSM510 激光扫描共聚焦显微镜 LSCM Laser Scanning Confocal Microscope 什么是“激光扫描共聚焦显微镜” 在荧光显微镜基础上配置激光扫描装置，共扼聚焦光路系统和计算机图像采集分析系统而形成的新型显微镜。 利用共聚焦光路和激光扫描获得生物样品的荧光图像、显微断层图象、动态扫描记录、三维立体构建。 激光共聚焦显微镜构成 共扼聚焦原理图 激光共聚焦显微镜的优点 激光做光源，光色纯，波长固定，成像效果好，分辨率高，图象清晰，荧光检测信噪比高 可实现分层扫描 可实现连续扫描，可动态记录变化 可多根激光管同时扫描，多色荧光同时成像 扫描速度快，对样品损伤小 激光共聚焦显微镜应用 荧光观测 动态测量 三维成像 荧光观测 高清晰成像 荧光强度测量 多荧光标记成像 荧光与透射光同时成像 高清晰成像 激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制，减少了成像的干扰，以及使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可达普通光学显微镜的1.4倍。 可以清晰的表现某些细微结构。 高清晰成像 高清晰成像 高清晰成像 高清晰成像 高清晰成像 高清晰成像 高清晰成像 高清晰成像 高清晰成像 荧光强度分析 荧光信号通过光电倍增管转化为电信号，经过电脑分析可对荧光信号进行相对定量测定。 荧光强度分析 荧光标记绝对值测量 多色荧光标记检测 普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多种荧光标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描，多通道同时探测。 透射光扫描（DIC） 利用激光透射扫描成像，用特殊滤光片达到相差显微镜的效果，可获得清晰的具有立体感的图片 培养细胞 荧光与透射光同时成像 利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组间荧光标记蛋白表达的差异。 荧光与透射光同时成像 动态观测 激光共聚焦显微镜的一大特点就是可以对活细胞进行连续扫描，实现实时动态观测。这样可记录细胞在外界某种条件的刺激下瞬时发生的变化。 常用的有检测细胞内游离Ca 离子变化、细胞内PH值变化，等等。 Ca离子动态检测 荧光染料：Fluo-3AM。 此染料可特异性标记细胞内游离Ca离子，胞外不标记。 Ca离子动态检测 心肌细胞搏动实时扫描 细胞膜流动性测量 构成细胞膜的脂质和蛋白质分子具有一定的流动性。采用荧光漂白漂白恢复技术可以无创性分析活细胞膜成分和细胞质结构的动态变化。 荧光漂白漂白恢复技术 其原理是利用高强度的激光束照射活细胞表面的某一区域，使该区域荧光淬灭或漂白，然后再利用较弱的激光束照射该区域，检测荧光强度的恢复情况（细胞膜上其他地方的荧光探针流动到漂白区域），从而来推断细胞膜的流动性 细胞膜流动性测量 细胞膜流动性测量 分层扫描（切片扫描） 按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小，可控制样品扫描层面的厚度。即样品中相当薄的一层被探测到，而其他层面不影响成像。 分层扫描（切片扫描） 当观测较厚样品时，普通透射光不能透过样品，则可以通过切片扫描检测荧光的方法来观测。 分层扫描（切片扫描） 分层扫描（切片扫描） 分层扫描（切片扫描） 连续分层扫描，可得到CT片类似的效果，对样品Z轴的结构进行分析。经计算机数据重组，可观测空间结构，空间定位，三维重组。 利用专用图象处理软件，还可以实现其他许多数据分析。 分层扫描（切片扫描） 细胞“CT”片 常用荧光探针介绍 细胞活性探针 细胞器探针 细胞骨架探针 核酸探针 细胞内离子探针 细胞活性探针 活细胞探针：吖叮橙（AO） 是一种离子泵活性指示剂，弱碱性，在动物细胞溶酶体、植物液泡和含胰岛素的分泌小粒等酸性细胞器中浓集。 死细胞探针：碘化丙锭（PI） 膜不透性DNA探针，细胞膜破损后与DNA结合 细胞器探针 线粒体探针：罗丹明123（Rhodamine123），能渗入细胞，带阳离子的荧光探针，不染色内质网。 溶酶体探针：中性红（Neutral Red） 内质网探针：DiOC6（3）属于短链碳酸花青苷染料。可标记活细胞内质网，也可用于甲醛固定的细胞内质网。（但现在尚无一种理想的内质网特异性探针，因此类染料内质网和其他细胞器同样着色，必要时可用内质网特异蛋白抗体。） 细胞骨架探针 F-肌动蛋白荧光探针： 鬼笔环肽：特异性与F-肌动蛋白荧光探针结合，纳摩尔浓度下也可标记 核酸探针 吖叮橙（AO） 与DNA结合，发射波长525nm，显绿色与RNA结合，发射波长650nm，显红色 Hoechst：专一性与DNA结合，分辨率高 DAPI：与双链DNA结合荧光增强20倍，与单链DNA结合无荧光增强。荧光强度比Hoechst