免疫荧光染色步骤.DOC

免疫组织化学染色步骤 1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ10min）、入水（100%酒精Ⅰ5min→100%酒精Ⅱ3min→95%酒精2min→80%酒精1min→70%酒精1min），蒸馏水冲洗后，0.01M PBS冲洗，5min×3次； 2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15min，自然冷却至室温，0.01M PBS冲洗，5min×3 3．3%H2O2溶液，37℃，20 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M PBS冲洗，5min×3 4．正常羊血清封闭，37℃， 5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M PBS冲洗， 6．滴加二抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次； 7．滴加三抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3 8．DAB避光显色，显微镜下控制显色时间； 9．0.01M PBS终止显色； 10．梯度酒精脱水（70%酒精1min→80%酒精1min→95%酒精Ⅰ1min→ 95%酒精Ⅱ1min→无水酒精Ⅰ10min→无水酒精Ⅱ10min），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15min→二甲苯Ⅱ10min； 11．中性树胶封片。 免疫荧光染色步骤 (1)将组织切片脱蜡入水； (2)抗原微波修复，温度92℃ (3)正常羊血清封闭，37℃ (4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，PBS冲洗， (5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 min，0.01M PBS冲洗，5min×3 (6)防淬灭封片剂封片，4℃ (7)荧光显微镜观察拍照。 细胞免疫组化染色（培养板中染色） 1．培养的细胞，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。2．在含0.1% Triton X-100（4孔板200μl）的PBS中进行10min的透膜处理，PBS洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。3．羊血清用PBS配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。4．吸尽液体，勿洗，添加一抗，于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，PBS洗3次，每次 5．去除一抗后，细胞用PBS洗三次。 6．加入二抗，然后加入相对应的孔，在37℃下作用30-60min。PBS洗3次，每次5-10分钟 7．吸尽液体，加入三抗，在室温条件下作用30-60min。PBS洗3次，每次5-10分钟。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗及三抗的细胞作为阴性对照组。 8．DAB避光显色，显微镜下控制显色时间； 9．PBS终止显色；显微镜下观察拍照。 细胞免疫荧光染色（培养板中染色） 1．培养的细胞，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。2．在含0.1% Triton X-100（4孔板200μl）的PBS中进行10min的透膜处理，PBS洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。3．羊血清用PBS配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。4．吸尽液体，勿洗，添加一抗，于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，PBS洗3次，每次 5．去除一抗后，细胞用PBS洗三次。 6．滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 min，0.01M PBS冲洗，5min×3 7．防淬灭封片剂封片，4℃ 8．荧光显微镜观察拍照。 细胞爬片后的步骤同切片的免疫组织化学及免疫荧光的步骤。 HE染色 1. 石蜡切片常规脱蜡入水：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15min→100%酒精Ⅰ、Ⅱ→95%酒精Ⅰ、Ⅱ→80%酒精→70%酒精→50%酒精各1-2min。 2．水洗：普通水洗2次，蒸馏水洗1次。 3. 苏木素染色10min。 4. 充分水洗：自来水洗10min。 5. 盐酸酒精分色：分色10-30s，随时镜检分色程度，使不该着色的部分全部褪去，应着色的部分着色适当。着色标准：胞核为深蓝色，胞质无色或浅灰色。 6. 充分水洗：自来水洗10min。 7. 氨水蓝化2-3min。 8. 充分水洗：自来水洗10-15min，水洗后若染色太浅则可重新返回苏木素。 9. 脱水：70%、80%酒精各1-2min。 10. 伊红染色0.5min左右，随时镜下观察，染色不宜过深，要与苏木素作对比，要协调鲜明。 11． 脱水透明：95%酒精Ⅰ、Ⅱ各1-2min→100%酒精Ⅰ、Ⅱ各15min→二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15min。 12．中性树胶封片。