关键基因的修饰对枯草芽孢杆菌尿苷合成的影响-微生物学报.PDF

微生物学报 Acta Microbiologica Sinica 2016, 56(1): 56-67 /actamicrocn DOI: 10.13343/ki.wsxb Research Paper 研究报告 关键基因的修饰对枯草芽孢杆菌尿苷合成的影响 1 2 1 * 2 杨绍梅 ，郭磊，班睿 ，谢希贤 1 天津大学化工学院，系统生物工程教育部重点实验室，天津 300072 2 天津科技大学生物工程学院，代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津 300457 摘要： 【目的】探究磷酸核糖焦磷酸(PRPP)合成酶(prs )和氨甲酰磷酸合成酶(pyrAA/pyrAB ) 的点突变，以 及异源5′-核苷酸酶(sdt1) 的过表达，对枯草芽孢杆菌尿苷生物合成的影响。【方法】依据推断的变构位 点，分别在prs 基因和pyrAB 基因编码序列中引入点突变；将点突变的prs 基因在染色体xylR位点整合表 达，pyrAB 基因则在染色体原位被修饰；sdt1基因在染色体sacB位点整合过表达。通过对重组菌摇瓶发酵 液中尿苷、胞苷和尿嘧啶的分析，表征相关基因修饰对尿苷合成的影响。【结果】在PRPP合成酶中引入 Asn120Ser 、Leu135Ile和Glu52Gly或Val312Ala点突变，分别导致尿苷积累量提高67%和96% 。进一步在 氨甲酰磷酸合成酶中引入Ser948Phe、Thr977Ala和Lys993Ile点突变，导致尿苷积累量又增加了182%，达 到6.97 g/L 。在此基础上，过表达异源5′-核苷酸酶，导致尿苷产量增加17% ，达到8.16 g/L 。【结论】 PRPP合成酶和氨甲酰磷酸合成酶的酶活或反馈抑制调节机制，是限制尿苷过量合成的重要因素。 PRPP合成酶的Asn120Ser 和Leu135Ile点突变，以及氨甲酰磷酸合成酶的Ser948Phe 、Thr977Ala 和 Lys993Ile点突变，能够显著促进尿苷合成。PRPP合成酶附加的Glu52Gly或Val312Ala点突变，有利于尿 苷合成。异源的嘧啶专一性5′-核苷酸酶的引入，也对尿苷的合成有明显的促进作用。 关键词：PRPP合成酶, 氨甲酰磷酸合成酶, 5′-核苷酸酶, 尿苷合成, 枯草芽孢杆菌 尿苷(Uridine)化学名为1-β-D-呋喃核糖苷尿嘧 ka Tsunemi等采用诱变筛选尿嘧啶结构类似物抗 啶，作为合成某些抗病毒或抗肿瘤药物的原料， 性突变株的育种方法，成功地获得了过量合成尿 [ 1 ] [3–4] 在制药工业中有一定的需求 。枯草芽孢杆菌 苷的B. subtilis突变株 。但国内研究者采用相同 (Bacillus subtilis)具有嘧啶核苷酸从头合成途径， 育种方法筛选出的抗性突变株，尿苷产量远低于 [5] 以及以尿苷单磷酸(UMP)为前体物的尿苷生物合 国外文献报道水平 。基因工程技术已经应用于 [2] 成途径 ( 图1)。但野生型B. subtilis在一般培养条 尿苷生产菌株的遗传育种，朱晖等采用基因操作 件下，发酵液中不能积累可检测量的尿苷。