利用单链DNA模板-西北师范大学.PPT

第五节 DNA核酸序列分析 目的与要求 2.5.1 Sanger双脱氧链终止法 引物—延伸测序策略 2.5.1 .1 Sanger双脱氧链终止法原理 酶、原料比例 2.5.1.2 Sanger双脱氧-M13体系 DNA序列分析法 克服缺点的一种途径—DNA分子克隆 M13载体克隆DNA片段 使用M13载体系列的优点 2.5.1.3 Sanger 双脱氧一pUC体系 DNA序列分析法 Sanger 双脱氧一pUC体系 DNA序列分析法基本步骤 2.5.2 Maxam－Gilbert化学修饰法 2.5.2.1 Maxam－ Gilbert化学修饰法的原理 碱基特异的化学切割反应——肼（NH2·NH2） 碱基特异的化学切割反应——硫酸二甲酯［（CH3O）2SO2］ 2.5.2.2 化学修饰法测序图解 2.5.2.3 Maxam－Gilbert化学修饰法优点 2.5.4 DNA杂交测序 杂交的检测 杂交测序的应用 2.5.5 DNA策序的商业运作及存在问题 “测序”思考回答问题 第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定 西北师范大学 精品课程 武国凡 基因工程 第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定 西北师范大学 精品课程 武国凡 基因工程 返回第二章 掌握DNA测序的一般原理和方法，通过学习，分析DNA策序与蛋白质策序的区别。 重点： Sanger双脱氧链终止法策序原理和方法 难点：如何根据凝胶电泳直接读出DNA序列 学时：2学时 学习方法：课堂讲授与讨论相结合 2.5.1 Sanger双脱氧链终止法 ■ 2.5.2 Maxam－Gilbert化学修饰法■ 2.5.3 序列分析自动化■ 2.5.4 杂交测序■ 2.5.5 DNA策序的商业运作及存在问题■ 2.5.6 思考问题■ 60年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实 第一，如何分离寡核苷酸片段； 另一方面，在研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。 返回 DNA核酸序列分析历程 1968年华裔生物化学、生物学家吴瑞博士（Dr．Ray Wu） 独创性地设计出一种崭新的引物一延伸测序策略，并于1971年首次成功地测定了λ噬菌体两个COS末端的完整序列； 1977，F.Sanger在该策略的基础上，发展出了快速测定DNA序列的末端中止法； K. Mullis采纳他的方法，完善了PCR扩增DNA的方法； M．Smith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全都获得了诺贝尔奖。 利用DNA聚合酶的两种酶催反应特性：1、利用单链DNA模板，合成DNA互补链；2、利用2’，3’双脱氧核苷三磷酸作底物，参入到寡核酸链的末端，从而终止DNA链的生长。 也称引物合成法，或酶催引物合成法。 反应：同时加入引物和模板、DNA聚合酶1、一种ddNTP、以及 四种dNTP（有一种带放射性标记）。 变性胶电泳分离反应混合物。 放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性带。 结果判读，从放射性X光底片上，直接读出DNA的核酸顺序。 GTACGTTGACGCC ddATP ddTTP ddGTP ddCTP ddCTP ddATP ddGTP ddTTP AGTCAGGATCACC 考考你 dNTP／ddNTP=1：100时，谱带分离效果较佳，可读出多于 200个以上的核苷酸顺序。 降低ddNTP对dNTP浓度比，会产生逐渐加长的片段，再配合使用长胶和低浓度的聚丙烯酰氨凝胶，分辨能力可提高到能判读出300个左右的核苷酸顺序。 引物合成DNA序列测定法的特点及缺陷 分析：这样处理后，能策得高分子量DNA吗？ 为了将这些降解的DNA片段，按其原来的顺序“拼排”起来，至少还需要用一种或数种其它内切限制酶，对同种DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。 高分子量DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳分离纯化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。 费时、费力、费钱、DNA损伤严重 将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到载体分子上。选用天然的单链 DNA噬菌体，例如 M13作为载体，重组体噬菌体的DNA分子，可直接用作模板。 引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体DNA中分离出来的一种限制片段。其特点是能够特异性地同载体分子上与克隆位点相连的单链DNA区段杂交。称做“通用引物” 。 将DNA片段克隆在M13mp载体特定LacZ区段中 重组体噬菌体在含有IPTG和Xgal的培养基平板上形成白色的噬菌斑; 非重组体的噬菌体则形成蓝色的噬菌斑。 从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链DNA，就可以直接按双脱氧链