基于IgY哈氏弧菌快速检测方法建立及其被动免疫保护分析-遗传学专业论文.docxVIP

分析与讨论 分析与讨论 25 小结 27 第三章抗哈氏弧菌卵黄抗体对黑鲷被动免疫保护 ．28 材料与方法 28 结果 33 分析与讨论 42 ，J、结 44 参考文献 45 附录 ．．48 致谢 ．．49 2 参考文献 参考文献 ．．一 ．．58 独创性声明 ．．62 3 性卵黄抗体，从抗体的提取、纯化等方面进行了进一步的优化研究；建立基于IgY 性卵黄抗体，从抗体的提取、纯化等方面进行了进一步的优化研究；建立基于IgY 的快速、准确、定量的酶联免疫吸附试验(EusA)检测抗原菌浓度的技术；同 时开展抗哈氏弧菌卵黄抗体对黑鲷被动免疫的研究。本研究在一定程度上缓解了 鱼类疾病的防治中抗生素带来的种种弊端，为鱼病病原的快速检测提供理论基 础，为特异性IgY被动免疫保护机理提供理论基础。 方法 1．采用饱和硫酸铵沉淀法和葡聚糖凝胶SephadexG．75凝胶柱层析，分离和纯化 特异性卵黄抗体，然后采用SDS．PAGE分析纯化蛋白的部分特性，将其作为 建立间接ELISA检测抗原的一抗。 2．建立基于IgY的间接ELISA测定抗原浓度的技术方法，确定抗原包被浓度、 一抗IgY和酶标二抗最适稀释倍数，抗原包被条件的选择，底物的最佳反应 时间等间接ELISA的实验条件。 3．在黑鲷感染哈氏弧菌前或后通过口服或注射抗哈氏弧菌特异性IgY，用间接 ELISA法对黑鲷血清及脾、肝、肾、肠、鳃、肌肉中IgY水平进行检测，分 析IgY在黑鲷体内的吸收规律。 结果 1．通过硫酸铵沉淀法和SephadexG．75凝胶柱层析方法分离，获得纯度较高的免 疫球蛋白，经p．巯基乙醇处理后解离形成重链和轻链两个亚单位，分子量分 别为67 kD、23 kD。 2．建立了基于IgY的间接ELISA测定哈氏弧菌的方法，试验的最佳反应条件为： 抗原最适工作浓度浓度为lxl08 cfu／mL，包被412过夜；一抗IgY稀释度分 别为1：28；购买的兔抗鸡IgY-HRP酶标抗体作1：20000稀释；选择底物的最 佳反应时间为20 min。 3．注射和口服抗哈氏弧菌特异性IgY对黑鲷能产生较好的免疫保护效果。其中 连续口服组6 d组在血液，肝、肾、肠中存在较高的抗体，可以持续较长时 间的免疫，为最佳预防免疫途径，早期感染治疗使用口服方式比较好。 ：：一．二二：．； ：：一．二二：．； ：： 塑丛堕堂堕塑主坠塞 ‘～ ．．．-。’：‘- 结论j j～7．’：。。 l、成功纯化出抗哈氏弧菌特异性IgV，重链和轻链的分子量分别为67 kD、23 kD： 2、建立了基于IgY检测哈氏弧菌的间接ELISA检测技术，最佳反应条件为：抗 原最适工作浓度浓度为lxl08 cfil／mL，包被40过夜；检测血清稀释度分别为 1：28： 购买的兔抗鸡IgY-HRP酶标抗体作1：20000稀释；选择底物的最佳反 应时间为20 rain。 3、抗哈氏弧菌特异性IgV能显著增强黑鲷对哈氏弧菌感染的保护力。连续口服 6 d能使血清和肝、肾等免疫器官内产生较高的IgY浓度。注射途径给予要使 注射浓度达到l m酌nL，血清和各免疫器官才能产生相应的浓度，具有一定 的保护力。 关键词 哈氏弧菌；卵黄抗体IgY：硫酸铵沉淀；葡聚糖SephadexG-75凝胶层析；间 接ELISA；黑鲷；被动免疫 2 antibiotics antibiotics in fish disease prophylaxis and treatment,provides theoretical basis for fish disease pathogen of rapid detection and for specific IgY passive immunization protection mechanism． Methods 1．The purification of lgY Was carried out by using ammonium sulfate precipitation followed by Sephadex G-75 gel filtration chromatography,and then analyzed And partial characteristics of purified protons by SDS—PAGE．Then it is as primary antibody in establishing indirect ELISA． 2．Establish an Indirect ELISA based on specific IgY to detect the concentration of Antigens bacteria．Eight experiment condi