基于HPV6、11之L1蛋白表位多肽疫苗的设计及其免疫学效应研究-医学免疫学专业论文.docxVIP

基于HPV6、11之L1蛋白 表位多肽疫苗的设计及其免疫学效应研究 摘 要 尖锐湿疣是由大约8kb的双链DNA病毒，主要是由HPV6、11、16、18型病毒感染 生殖器及肛周复层上皮的基底层和棘层细胞所引起的。它是一种全球高发的性传播疾 病。免疫生物学的快速发展保证了HPV疫苗研究的深入。虽然HPV严格的种属性限制 了动物模型的发展，但是一些动物乳头瘤病毒感染的研究，例如兔、牛和犬，支持了 疫苗可以阻止或清除HPV感染的观点。HPV的结构蛋白L1、L2，非结构蛋白E1，E2， E6和E7可作为疫苗，并可在细菌中制备获得，通常融合成细菌蛋白。 在模式动物中，接种 L1 和/或 L2 病毒壳蛋白可以提供有效的抗感染保护，包括 病毒型特异性的中和抗体。接种非病毒结构的 E1，E2，E6 或 E7 蛋白疫苗，不能阻止 感染，除非与 L1 和/或 L2 同时免疫。通过 DNA 重组技术，基于 HPV6/11 型 L1 或 L1 和 L2 蛋白自我组装成病毒样颗粒的研究已经进入了 I/II 期临床实验。第二代疫苗是融 合蛋白或包含结构蛋白 L1/L2 以及非结构蛋白 E6，E7 或 E2 融合蛋白的 VLPs，该类 疫苗可能诱导体液免疫应答和细胞免疫应答。目前正在研究怎样提高疫苗效价和最佳 的免疫途径(全身或局部)，以期获得最佳免疫应答效应。基于 HPV E6 和/或 E7 的重组 子，以及根据 CTL 表位肽的 L2-E7 融合蛋白或 E7 肽的治疗性疫苗，已进入宫颈癌临 床前期或高度上皮细胞损害病人的 I/II 期实验。 在本实验中，我们分别采用 Goldkey 和 PC/Gene 软件系统，根据 HPV6，11-L1、 L2 外壳蛋白的特征、特性，寻找 L1 蛋白的 B-细胞表位，最后用抗原性指数(AI)综合 评判 L1 蛋白的 B 细胞优势表位；并合成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四种抗原表位多肽。Chousman 方案预测 L1 蛋白之二级结构。在 L1 分子中，呈转角结构(T)、伸展结构(E)、无规卷 曲结构(C)、螺旋结构(H)的氨基酸残基分别占 27.54%、32.34%、20.76%、19.36%。第 18-38 位、40-60 位、118-138 位、340-360 位、420-440 位、480-501 位的氨基酸序列 具有较强的抗原性；第 120-140 位、345-360 位、420-440 位、480-501 位的氨基酸序 列是理想的 B-细胞表位；第 426-439 位和第 487-501 位的抗原性指数分别为 0.0508 和 0.0578。 为了比较基于不同组合而获得的四种合成肽的不同免疫原性，免疫 Balb/c 小鼠获 得多克隆抗体，我们采用第 0、2、4 周的免疫程序，将加入福氏完全佐剂(CFA)的 4 种合成肽皮下注射 Balb/c 小鼠，应用相同和不同的免疫剂量，获得免疫血清的抗体效 价；测定了小鼠抗血清与患者疣体血清的交叉反应、细胞因子 IFN-γ和 IL-4、脾淋巴 细胞增殖测定；以及使用相同免疫剂量(50μg/只)，在免疫后第 0，2，4 周的三次血清 抗体和脾细胞增殖的测量，都呈现出了表位多肽诱导抗体滴度的趋势为：ⅣⅠⅢ Ⅱ；而用相同的免疫剂量，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 四种肽分别在免疫后的第 2，6，4，2 周 出现阳性血清，剂量均为 80μg/只。采集临床患者疣体组织细胞破膜后，确定患者疣 体 HPV 型别，PCR 鉴定的阳性率为 83.33％。以患者不同型别的 HPV 包被酶联板， 测定四种表位多肽免疫小鼠后第 6 周，获得抗血清的交叉反应，表位多肽Ⅳ诱导的阳 性血清，对 HPV－6、11 型的抗体效价均达到了 6400；表位多肽Ⅰ诱导的阳性血清， 对 HPV－6、11 型的抗体效价也达到了 6400；表位多肽Ⅲ和Ⅱ对 HPV-6 和 11 型的抗 体效价分别为 3200 和 1600。在免疫后的第 4 和第 6 周，诱导出了细胞因子 IFN-γ 和 IL-4，但诱导强度为：表位多肽ⅣⅠⅢⅡ。 在本研究中，根据 HPV-L1 外壳蛋白的优选表位多肽，设计并合成四种抗原肽Ⅰ、 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，并对其免疫原性进行了研究，为多肽疫苗的研制提供了可靠依据。通过 对表位的合理组合与搭配，获得的多肽疫苗可能是一个有前途的预防尖锐湿疣的方法。 关键词：尖锐湿疣，人乳头瘤病毒，B-细胞表位，免疫原性，多肽疫苗 Design and Evaluation of Epitope Polypeptide Vaccine Based on L1 Capsid Protein of HPV6 and11 Abstract Human papillomaviruses (HPV) are double strand DNA viruses