第二章 DNA重组克隆的单元操作..ppt

第二章 DNA重组克隆的单元操作;本章节内容;第一节 DNA重组的载体;载体的功能;载体必须具备的三个条件;一、质粒载体;（一）质粒的基本性质 质粒通常赋予寄主一些表型特征，如抗生素抗性等。 选择性标记(selectable marker):由于质粒携带的基因，可供实验室条件下进行选择的一些标记。如抗性，营养元素的利用等。显性质粒与隐性质粒. ;（一）质粒的基本性质 1、质粒的自主复制性：含有Ori或replicon 质粒在特定的宿主细胞中维持恒定的拷贝数。 A、反义RNA进行调控的机制 B、关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理 ;A、反义RNA进行调控的机制（plasmid Col E1 ）;B、 如果RNA I和RNA II形成双链RNA螺旋，RNA酶H不能降解RNA II，复制不能进行。;c、 当质粒的浓度比较高的时，Rop蛋白促进RNA I和RNA II形成双链RNA螺旋，使质粒的复制不能起始。 d 、 当质粒的比较低时，RNA II与质粒DNA形成RNA-DNA复合物，RNA酶H降解RNA II 质粒复制起始。 e、突变RNA I或去除Rop基因导致质粒的拷贝数增加。;B、关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理（ pS101质粒）;B、关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理 ;质粒拷贝数由RepA蛋白浓度和质粒自身的浓度进行调节。 如果质粒拷贝数高， RepA蛋白与自身的启动子区域结合，抑制转录，RepA蛋白合成受阻，DNA的复制受到抑制。 RepA蛋白通过结合到两个质粒的重复序列把它们连接起来，避免复制起始。 细胞分裂后，拷贝数和RepA蛋白的浓度降低， RepA蛋白自身合成增加，结合到重复区域起始DNA的合成 。;问题：在寄主复制后，质粒是如何分配到子细胞中？ Par原件会附着在细胞膜上，随着细胞的分裂，质粒正确 分配到子细胞中，维持相对稳定的质粒拷贝数。;（一）质粒的基本性质;（一）质粒的基本性质;（一）质粒的基本性质;（一）质粒的基本性质;（二）、质粒的改造和构建;R7268 ApR;（三）、质粒的分类及用途;;（三）、质粒的分类及用途;三、质粒的分类及用途;无启动子序列;（三）、质粒的分类及用途;;pGEM载体—克隆DNA的体外转录 加入了两个短片段，这两个片段在限制性酶切位点的两侧，可被T7噬菌体的RNA聚合酶或SP6 T7噬菌体的RNA聚合酶的识别 方便了克隆DNA的体外转录，便于研究RNA加工，合成蛋白质等的研究等 ;pGEM-3Z;（四 ）、质粒DNA的制备;超螺旋 DNA;碱变性 用CsCl-EB等密度离心 ;总结质粒载体;（一）、 噬菌体的生物学特征 λ噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子， 长48 502bp。 基因簇集排列 线λ噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期 线性λ噬菌体两端各有12个碱基的5’凸出黏性末端是互补的,该互补序列相互作用形成cos位点。 作用：进入细胞的λDNA通过两端的黏性末端环化。 ;;;;1、对野生λ噬菌体的改进 A、 删除多余的限制性内切酶的位点。 B 、切除一些非必需序列，增加载体的容量。 C、设计阳性选择重组子的方法。 D、发展可以使插入的真核cDNA与β－半乳糖苷酶形成融合蛋白的载体。 ;2 、λ噬菌体基因组可删除的部分不影响生存能力;3、重组噬菌体的鉴别;3、 重组噬菌体的鉴别;3、重组噬菌体的鉴别;（左右臂连接） （三段自身连接） （插入片段） ;根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选;插入型载体：只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。 失去了非必需区 切点又位于报告基因上，故在切开DNA并插入外源基因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选 可插入长度为10kb的外源DNA ;两种报告基因的插入型载体 cI基因内保留HindIII和EcoRI单酶切位点，当有外源DNA在这酶切位点插入时，使cI基因失活，感染hfⅠ-大肠杆菌后可形成空斑（ 如λgt10） 。 在噬菌体DNA插入的lacZ基因末端设有单一的EcoRⅠ酶切位点。在此处插入外源基因，可表达β-半乳糖苷酶的融合蛋白，利用特异性抗体或DNA测序方法可筛选重组DNA。这类载体适宜构建cDNA文库(如λZAPII); cI;取代型载体：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的λ DNA区段可以被外源插入的DNA所取代。 可克隆的片段大，最大可达25kb，而质粒最大仅10 kb左右； λDNA的长度介于野生型λ噬菌体DNA长度的75％而不超过其105％时，才能被包装成噬菌体颗粒，当DNA的长度短于野生型的75%或超过105