项目一动物组织中核酸的自提取与鉴定.pptVIP

项 目 一 动物组织中 核酸的提取与鉴定 一、实验目的 学习和掌握用盐溶法从动物组织提取核酸的原理和操作技术。 了解定性鉴定核酸的原理和方法。 二、实验原理 根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离，然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，达到分离提纯的目的。 三、实验材料 试剂 地衣酚（orcinol）试剂： 称取100mg地衣酚溶于100ml 浓盐酸中，再加入100mgFeCl3·6H2O，该溶液应在使用前新鲜配制。 二苯胺试剂： 称取1g二苯胺（经重结晶）溶入100ml冰醋酸中，再加入2.75ml浓H2SO4摇匀，冰箱内保存备用。 三、实验材料 试剂 0.14mol/L氯化钠溶液 （内含0.01mol/L柠檬酸），250ml； 1mol/L氯化钠溶液，250ml； 95%乙醇（冷）； 氯仿； 异戊醇。 三、实验材料 实验器材 冷冻离心机（3000rpm）； 组织捣碎机或组织匀浆器； 不锈钢剪刀； 冰浴； 试管、试管夹； 量筒、吸管； 带塞比色管、带塞离心管。 玻棒、烧杯； 电炉等。 四、实验方法 1. 制匀浆 将新鲜肝脏或冷冻肝脏称重后用冷的0.14mol/L氯化钠溶液（内含0.01mol/L柠檬酸）洗去血水，用不锈钢剪刀将肝脏剪成碎块，放入组织捣碎机中加入2倍体积的0.14mol/LNaCl溶液（内含0.01mol/L柠檬酸）制备匀浆。 将匀浆置离心机中离心20min（3000rpm）。上层液倾出留待抽提RNA ，下层用二倍体积冷的1mol/LNaCl溶液抽提1h，待分离DNA核蛋白。 四、实验方法 2. 核酸的抽提 RNA的提取 0.14mol/L的NaCl抽提液（内含RNA核蛋白）加入等体积的氯仿和1/40体积的异戊醇，置带塞离心管中，振摇30min，此时提取液为乳白色混悬液，以3000rpm离心15min，离心物呈三层。 用滴管吸出上层清液，在低温下加入1.5~2倍的冷95%乙醇，并轻轻搅拌。低温放置15min，3000rpm离心10min，弃去上清液，即得RNA颗粒状沉淀，待定性。 四、实验方法 2. 核酸的抽提 DNA的抽提 将抽提1h的1mol/LNaCl匀浆悬液以3000rpm离心20min，弃去沉淀，将其上清液倒入带塞的离心管中，加入等体积的氯仿及1/40体积的异戊醇振摇30min，离心20min。将其上清液加入2倍体积的冷95%乙醇，边加边摇，抽出玻棒，纤维状DNA就缠绕在玻棒上待定性。 每次都需采用冷冻离心。 四、实验方法 3. 定性试验 RNA的呈色反应 取2支干净试管，一管加入1.5ml RNA溶液，另一管加入蒸馏水1.5ml，向两管中加入3ml地衣酚试剂，于沸水中加热10min，由黄色变为绿色为阳性反应。 DNA的呈色反应 取2支干净试管，一管加入1.5mlDNA溶液，另一管加入蒸馏水1.5ml，向两管中加入3ml二苯胺试剂，于沸水中加热10min，由乳白色变为蓝色为阳性反应。 五、注意事项 在提取分离纯化核酸时，为了保持核酸的完整性，防止核酸变性降解，操作时必须防止过酸或过碱。全部过程应在低温下(0℃左右)进行，必要时还需加入抑制剂，以抑制核酸酶的作用。 加氯仿、异戊醇后振摇要充分，但又不能太剧烈，以防DNA断裂。 要学会正确使用离心机，离心后，注意上清液和沉淀的取舍。 六、项目总结及练习 六、项目总结及练习 六、项目总结及练习 六、项目总结及练习 六、项目总结及练习 六、项目总结及练习 六、项目总结及练习 8、 金属螯合剂（metal chelating agent） 金属螯合剂可以通过螯合剂分子与金属离子的强结合作用，将金属离子包合到螯合剂内部，变成稳定的，分子量更大的化合物，从而阻止金属离子起作用，可以用于解毒，印染，阻垢等方面。 四、蛋白质的变性 影响因素： 温度 紫外线、超声波 剧烈震荡、搅拌 强酸、强碱 有机溶剂、表面活性剂 重金属盐 胍、尿素等 4、SOD活力测定（邻苯三酚自氧化法） 分别检测提取液、粗酶液、酶液1、酶液2中SOD活力。 分别从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度. 提取液稀释:50 × 粗酶液稀释:20 × 酶液稀释:10 × 蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280 – 0.74A260) ×稀释倍数 6、计算： 酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）×5