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现代生物工程制药专题 * 浅谈基因工程药物酵母表达系统 高效表达调控研究进展 主要内容 基因工程药物 酵母表达系统 毕赤酵母表达系统优点 毕赤酵母表达载体 毕赤酵母表达菌株 影响目的基因高效表达的因素 * * 浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展 1　基因工程药物 基因工程药物研制过程 * 浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展 基本原理 　通过先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质，然后利用限制性内切酶，从外源基因中将控制该蛋白质合成过程的目的基因取出来，再通过 DNA连接酶把目的基因与载体（质粒 噬菌体 病毒） DNA 连接，接着转入微生物或细胞内进行克隆，并使目的基因最终在宿主细胞内成功表达，获得所需的蛋白质。 * 基因工程药物治疗肿瘤 基因工程药物治疗病毒感染 基因工程药物治疗心脑血管疾病 基因工程药物治疗其他疾病 浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展 最新进展 * 酿酒酵母表达系统 甲醇酵母表达系统 其他酵母表达系统 浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展 2 酵母表达系统 * 指可利用甲醇做单一碳源的一类酵母。 毕赤酵母（Pichia pastoris ) 汉森酵母（Hansenula ploymorpha） 假丝酵母（Candia boidinii） 浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展 甲醇酵母（methylotrophic yeast） * 具有强有力的乙醇氧化酶( AlocholOxidase, AOX1)基因启动子。 对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰 。 营养要求低, 生长快,培养基廉价, 便于工业化生产。 具有强烈的好氧生长偏爱性,可进行细胞高密度培养 。 遗传稳定, 表达量高 。 所分泌的糖蛋白的免疫原性较低, 而且表达产物不含有毒物质和致热原。 表达的蛋白可分泌到胞外, 十分有利于纯化。 浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展 2.1 毕赤酵母系统优点 * 自我复制型的游离载体 整合型载体 浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展 2.2 毕赤酵母表达载体 表达载体与宿主染色体重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达。 * 浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展 ↓ 启动子、 外源基因克隆位点、分泌信号、终止子、 选择标记、报告基因、复制起点、信号肽序列等 毕赤酵母模式表达载体 表达载体 * 乙醇氧化酶( Alochol Oxidase, AOX1）启动子被最早成 功地应用，也是目前最常用的启动子，它的甲醇诱导性很强，使在它控制下的外源基因能得到较高的表达。 浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展 毕赤酵母的启动子 * 浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展 毕赤酵母中有 2个醇氧化酶基因: AOX1和AOX 2 。 AOX 1可受甲醇专一诱导而高水平表达; AOX 2虽然在序列上与AOX 1的同源性达 97%及以上且表达的蛋白具有相似的生物学活性, 但AOX 1的表达水平却明显高于AOX 2 ，即启动能力强AOX 1﹥AOX 2 。 * AOX 1基因主要受诱导和抑制机制调控 当以甲醇为唯一碳源时, AOX 1基因的表达可被甲醇严格调控, 使得外源基因可严格保持在表达(有甲醇) -不表达(无甲醇) 的模式。 当以甘油或葡萄糖为碳源时, AOX 1的转录被抑制。 当AOX 1基因缺失时, AOX 2表达水平很低, 乙醇氧化酶活力极大丧失, 细胞利用甲醇能力极大降低。 浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展 * 作为筛选标记的基因和在细菌中进行复制起始点 和选择标记(如ColEI 复制起始点和抗氨苄基因) 浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展 毕赤酵母选择标记 选择标记 抗性标记 对应于营养缺陷型受体的野生型基因，如HIS4、ARG4、URA3 * 外源蛋白的分泌需要信号肽引导表达蛋白沿一定途径分泌至细胞外，外源蛋白