C5-2 基因操作中大分子分离和分析.pdfVIP

5.3.1 凝胶电泳技术的原理 5.3.1 凝胶电泳技术的原理 DNA在中性或偏碱性的条件下带负电，在电泳 DNA在中性或偏碱性的条件下带负电，在电泳 过程中处于负极的DNA通过凝胶分子筛向正极 过程中处于负极的DNA通过凝胶分子筛向正极 移动。迁移速度受电场强度、所带电荷数量及 移动。迁移速度受电场强度、所带电荷数量及 分子大小、构型等因素的影响，与DNA分子中 分子大小、构型等因素的影响，与DNA分子中 的碱基组成和顺序无关。 的碱基组成和顺序无关。 电泳结束后，用溴化乙锭（ethidium 电泳结束后，用溴化乙锭（ethidium bromide，EB ）或Goldview染色，可观察到 bromide，EB ）或Goldview染色，可观察到 DNA在凝胶中所处位置。 DNA在凝胶中所处位置。 5.3.2 琼脂糖凝胶电泳及其参数 琼脂糖 ：从海藻中提取的线性多聚体大分子。在 沸水中溶解，40 °C左右开始凝固，其单体分子 互相交联，形成立体网状结构，其孔径大小取决 于琼脂糖的浓度。 琼脂糖凝胶电泳参数： 1，琼脂糖的浓度 2，电泳缓冲液 3，DNA样品 4，电泳条件 5，EB染色和紫外观察 琼脂糖凝胶浓度 电泳缓冲液 TBE （Tris-硼酸缓冲液） TAE （Tris-醋酸缓冲液） TPE （Tris-磷酸缓冲液） TNE （Tris-乙酸盐缓冲液） DNA的样品 DNA分子大小 DNA分子构型 在一定范围内不同构型质粒的迁移率大 小比较：超螺旋线性双链单链开环。 加样量： 1μg；加样孔的1/2~2/3 载样缓冲液(loading buffer)： 蔗糖（8～10%）or 甘油（10%） 指示剂（0.4%溴酚篮） 电泳条件 电压：1～10V/cm DNA片段小：可高电压、较短时间电泳， DNA片段小：可高电压、较短时间电泳， 有利于 防止扩散 有利于 防止扩散 DNA片段大：需低电压电泳，减低电荷效 DNA片段大：需低电压电泳，减低电荷效 应，有利于DNA片段尽量按分子大小来分 应，有利于DNA片段尽量按分子大小来分 开。 开。 Southern 电泳也宜低压电泳 Southern 电泳也宜低压电泳 EB染色和紫外观察 EB染色和紫外观察 EB与DNA形成的络合物在302 nm紫外激发 EB与DNA形成的络合物在302 nm紫外激发 下，在590 nm有最大的荧光发射，较游离的 下，在590 nm有最大的荧光发射，较游离的 EB所发射的荧光强十倍以上。 EB所发射的荧光强十倍以上。 205 nm短波长紫外灯，会引起DNA的切割 205 nm短波长紫外灯，会引起DNA的切割 和二聚合作用，不利于目的片段的进一步研 和二聚合作用，不利于目的片段的进一步研 究。366 nm长波长紫外灯，产生的荧光较弱。 究。366 nm长波长紫外灯，产生的荧光较弱。 GoldView核酸染料 •灵敏度与EB相当，用法相同。100 ml胶溶 液加5 μl 。 •至今未发现有致癌作用，但对皮肤和眼睛 有一定刺激作用。 琼脂糖凝胶电泳的基本过程 琼脂糖凝胶电泳的基本过程 材料：电泳缓冲液、琼脂糖（电泳级）、溴化乙 材料：电泳缓冲液、琼脂糖（电泳级）、溴化乙 锭溶液、加样缓冲液、水平凝胶电泳装置及制胶 锭溶液、加样缓冲液、水