杭州开泰生物 Tn5甲基化建库试剂盒说明书.docxVIP

公司地址：杭州市西湖区青蓝科创园C座3号楼6楼 联系电话：0571 PAGE5 / NUMPAGES5 Tn5-Methy-DNAseq Library Prep Kit AT4103-01/02/03 使用说明书 产品简介 Tn5_Methy -DNAseq Library Prep Kit是针对illumina测序平台开发的全基因组甲基化文库构建试剂盒。试剂盒极大的简化了全基因组甲基化小片段文库构建过程，使用一步简单的酶促反应替代了传统甲基化文库构建过程中的片段化、末端修复以及接头连接反应等步骤，显著缩短了文库构建的时间。试剂盒操作简单，极大的避免了繁杂操作带来的误差，构建的文库均一性高。 试剂盒组成 产品成分 AT4103-01 （6次） AT4103-02 （24次） AT4103-03（96次） 保存条件 Tn5-Frag Buffer 12 uL 48 uL 192 uL -20℃ TnZ_Methy 12 uL 48 uL 192 uL -20℃ Stop Solution 60 uL 240 uL 960 uL -20℃ Strand-Enzyme Buffer 12 uL 48 uL 192 uL -20℃ 5mec-dNTP (10 mM) 12 uL 48 uL 192 uL -20℃ Strand-Enzyme 6 uL 24 uL 96 uL -20℃ Tn5-PCR Buffer 60 uL 240 uL 960 uL -20℃ dNTP(2.5 mM) 25 uL 100 uL 400 uL -20℃ Tn5-Universal Primer 6 uL 24 uL 96 uL -20℃ Tn5-PCR Enzyme 1.5 uL 5 uL 20 uL -20℃ 注意事项 试验前请仔细阅读本说明书，注意每个组分的保存温度，确保实验顺利完成。 操作过程请注意避免核酸样品和产物之间的交叉污染。 请使用不含RNA酶或DNA酶的枪头、EP管进行试验。 DNA浓度需使用Qubit测定，起始DNA量测定不准确，会影响文库得率； 实验所用磁珠应提前30分钟自4℃环境中取出，平衡至室温。所有磁珠操作均需置于室温。 80%乙醇需现配现用，用其清洗磁珠后，需清除干净，避免对后续反应产生影响。 需自备试剂和耗材 无水乙醇；NF-H2O；ATPure Plus beads（DNA片段分选纯化磁珠）或效果相同的纯化磁珠，亚硫酸盐处理试剂盒 200uL PCR管；1.5mL离心管；磁力架；  实验原理图 操作步骤 样本片段化反应： 1. 在新的PCR管中配制如下反应体系： DNA样品(5ng/50ng) X uL Tn5-Frag Buffer 2.0 uL TnZ_Methy 2.0 uL NF-H2O (6-X) uL 总体积 10.0 uL 移液器轻轻吹打20次充分混匀，55°C反应15分钟； 反应结束后加入10uL Stop Solution并且充分混匀； 2. 用磁珠纯化片段化产物，步骤如下： 将室温放置的30min后的ATPure Plus beads涡旋震荡混匀，并吸取20 uL至20 uL片段化产物中，移液器轻轻吹打10次充分混匀，转移混和样本至新的1.5 mL离心管中，室温孵育5分钟。 将反应管短暂离心并置于磁力架上，放置5min，待溶液澄清，移除上清。 保持离心管始终处于磁力架中，加入200 uL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒后移除上清。 重复步骤3，总计漂洗两次。 保持离心管始终处于磁力架中，开盖干燥5min。 将离心管从磁力架中取出，加入17uL NF-H2O洗脱。涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀。 将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清吸取15uL上清至200uL PCR管中，待用。 链置换反应 在新的PCR管中配制如下反应： Recovered DNA Fragment 15.0 uL Strand-Enzyme Buffer 2.0 uL 5mec-dNTP (10 mM) 2.0 uL Strand-Enzyme 1.0 uL 总体积 20.0 uL 移液器轻轻吹打20次充分混匀，65°C反应30分钟 重亚硫酸盐处理 本步骤为实验人员使用自备的亚硫酸盐试剂盒处理上步反应产物，具体实验步骤请参考相关试剂盒所提供的步骤，本步骤反应产物应立即用于下游实验。  PCR扩增： 在新的PCR管中配制如下反应： Recovered DNA Fragment （亚硫酸盐处理后）* X uL Tn5-