杭州开泰生物 链特异性转录组建库试剂盒说明书.docxVIP

公司地址：杭州市西湖区青蓝科创园C座3号楼6楼 联系电话：0571 PAGE5 / NUMPAGES5 SMART-RNAseq Library Prep Kit AT4201-01/02/03 使用说明书 产品简介 SMART-RNAseq Library Prep Kit是针对illumina测序平台开发的mRNA文库构建试剂盒。传统mRNA文库构建试剂盒需要经历mRNA分离、片段化、一链合成、二链合成、接头连接以及PCR扩增等繁琐过程，而本试剂盒使用一步简单的酶促反应替代了传统mRNA文库构建过程中的一链合成、二链合成、接头连接等步骤，减少了中间步骤的核酸损失，显著缩短了文库构建的时间。仅需6h即可实现从3ug-10ug的total RNA中分离出mRNA，并将其构建成高质量的mRNA文库。试剂盒操作简单，极大的避免了繁杂操作带来的误差，构建的文库均一性高。 试剂盒组成 产品成分 AT4201-01 （6次） AT4201-02 （24次） AT4201-03（96次） 保存条件 BOX1 Oligo d(T) Beads. 150uL 600uL 2.4 mL 4℃ Binding Buffer 150uL 600uL 2.4 mL 4℃ Washing Buffer 1.2mL 1.2mL*4 19.2 mL 4℃ Tris Buffer 150uL 600uL 2.4 mL 4℃ BOX2 SMART-Frag Buffer 12uL 48uL 192 uL -20℃ SMART-RT primer 3 uL 12 uL 48 uL -20℃ SMART-RT Buffer 13.5 uL 54 uL 48 uL -20℃ RNase inhibitor 1.5 uL 6 uL 24 uL -20℃ SMART-RT Enzyme 3 uL 12 uL 48 uL -20℃ Stranded Oligo 3 uL 12 uL 48 uL -80℃ SMART-Universal Primer 6 uL 24 uL 96 uL -20℃ PCR Master Mix 75 uL 300 uL 1.2mL -20℃ 注意事项 试验前请仔细阅读本说明书，注意每个组分的保存温度，确保实验顺利完成。 Stranded Oligo需-80℃保存，使用时少量分装使用。 操作过程请注意避免核酸样品和产物之间的交叉污染。 请使用不含RNA酶或DNA酶的枪头、EP管进行试验。 建库所使用的RNA必须是纯化后质检合格的样本，否则会严重影响建库结果； 实验所用磁珠应提前30分钟自4℃环境中取出，平衡至室温。所有磁珠操作均需置于室温。 80%乙醇需现配现用，用其清洗磁珠后，需清除干净，避免对后续反应产生影响。 需自备试剂和耗材 无水乙醇；NF-H2O；ATPure Plus beads（DNA片段分选纯化磁珠）或效果相同的纯化磁珠 200uL PCR管；1.5mL离心管；磁力架；水浴锅 实验原理图 操作步骤 mRNA分离： 预热65°C和80°C的水浴锅两个。 取RNA样品3-10ug加入到一个1.5mL的离心管中，用NF-H2O补至50uL，放置冰上备用。 取50uL Oligo d(T)的beads，加入到准备好的RNA样本中，用移液器吹打混匀。 将混合样本放入65°C水浴锅，放置5min，使RNA变性。 室温放置5min，使mRNA结合到磁珠上。 将样品置于磁力架上5min，待溶液清澈，小心移除上清。 加入200uL Washing Buffer，吹打混合均匀，在磁力架上放置5min，待溶液清澈，小心移除上清。 加入50uL Tris Buffer，重悬磁珠，混合均匀。 将样本放入80°C水浴锅，放置2min，室温放置5min，使mRNA洗脱下来。 加入50uL Binding Buffer，吹打混合均匀。 室温放置5min，使mRNA结合到磁珠上。 将样品置于磁力架上5min，待溶液清澈，小心移除上清。 加入200uL Washing Buffer，吹打混合均匀，在磁力架上放置5min，待溶液清澈，小心移除上清。 加入16uL NF-H2O，重悬磁珠，混合均匀。 将样本放入80°C水浴锅，放置2min，立即将样品置于磁力架上2min，待溶液清澈，转移15uL的上清液至一个新的200uL PCR管中，收集产物用于下游实验。 mRNA片段化： 1. 在新的200uL PCR管中配制如下反应： mRNA 15 uL SMART-Frag Buffer 4 uL S