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核 酸（II） ——理化性质和研究方法 核酸理化性质 一般理化性质 两性解离，一般为酸性 微溶于水，不溶于一般有机溶剂 DNA溶液粘度极高，RNA则小得多 化学反应 D-核糖与浓盐酸-甲基间苯二酚（苔黑酚）共热产生绿色，RNA测定反应 D-脱氧核糖与酸和二苯胺一同共热分成蓝紫色，DNA测定反应 光吸收性质 核酸在260nm处有强烈光吸收，可以通过OD260来定量分析核酸 1OD= 50?g/ml双螺旋DNA， 40?g/ml单链DNA（RNA），或20?g/ml单核苷酸 OD260/OD280可以鉴别核酸的纯度，DNA为1.8，RNA为2.0 核酸的变性与复性 变性：核酸原有的碱基配对关系和高级构象被破坏，成为无规线团，对DNA而言也指双螺旋的无规则拆分 变性后核酸性质的改变 光吸收增加，增色效应 粘度下降 浮力密度提高 生物学功能减弱或缺失 变性的因素 破坏氢键的因素 妨碍碱基堆积的因素 增加磷酸基静电斥力的因素 DNA热变性与Tm DNA的稀盐溶液加热到一定温度后，260nm的光吸收会骤然增加，增加幅度40%，表明DNA的热变性是一个突变过程。 熔解温度Tm：定义DNA热变性过程中，紫外光吸收增量到最大增量一半的温度为Tm 影响Tm的因素 核酸均一性：均一性愈高，熔解过程的温度范围愈窄 G-C对含量： G-C对含量越高， Tm越高，在1?SSC溶液中，(G-C)%=(Tm-69.3) ?2.44。SSC溶液：0.15mol/L NaCl, 0.015mol/L柠檬酸钠 溶液离子强度：离子强度越低， Tm越低 溶液pH：高pH容易变性， pH低于5.0则容易脱嘌呤 变性剂：甲酰胺、尿素、甲醛 核酸的复性 变性核酸的高级构象在适当的条件下重新恢复的过程称核酸的复性，对DNA而言指双螺旋结构的恢复 热变性的DNA的复性过程，需要缓慢的冷却过程，也称退火 核酸复性过程中光吸收下降，称减色效应 影响核酸复性的因素 温度，复性温度不宜过低，一般以Tm-25?C为宜。 核酸单链的浓度，一定范围内与浓度正相关 核酸长度，分子量大的复性慢 片段内重复序列多，易于复性 离子强度，一定的离子强度有利于核酸复性 分子杂交： 在复性的过程中，不同来源的核酸片段，可能因具有互补片段而相互结合形成双链，称分子杂交 核酸的水解 核酸的酸水解和碱水解 核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断 DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别 在0.1mol/L的NaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解，生成2’-或3’-磷酸核苷；DNA在同样条件下则不受影响 这种水解性能上的差别，与RNA核糖基上2’-OH的邻基参与作用有很大的关系，在RNA水解时，2’-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物 酸易水解N-糖苷键，嘌呤碱基比嘧啶碱基易被酸水解 脱氧核糖比核糖的糖苷键易水解，DNA的嘌呤碱在pH2以下即脱落而成无嘌呤酸 核酸的酶水解 核酸酶的分类 按底物专一性分：RNA酶(RNase)，DNA酶(DNase) 按作用方式分：核酸内切酶，核酸外切酶 按作用键分：分水解3’-磷酸酯键和5’-磷酸酯键的核酸酶产物分别是5’-磷酸核苷和3’-磷酸核苷 常用的几种核酸内切酶 牛胰核糖核酸酶(RNaseI)，水解嘧啶3’-磷酸和其他核苷酸5’-OH形成的酯键，产生3’-末端为3’-磷酸嘧啶核苷酸的核酸片段 核糖核酸酶T1，发现于米曲霉，水解3’-鸟苷酸与其他核苷酸5’-OH形成的酯键，产物为3’-鸟苷酸为末端的寡核苷酸 牛胰脱氧核糖核酸酶(DNaseI)，水解DNA 3‘-磷酸酯键，产生5’-磷酸的寡核苷酸，平均长度为4个核苷酸 牛脾脱氧核糖核酸酶(DNase II)，水解DNA 5-磷酸酯键，产生3’-磷酸的寡核苷酸，平均长度为6个核苷酸 限制性内切酶 可识别特异的碱基序列并将其水解断开，产物带5‘-磷酸 基，已发现数千种，是基因工程的重要工具酶 回文序列 粘性末端与平头末端 限制性酶切图谱 常用核酸外切酶 蛇毒磷酸二酯酶：水解3’-末端核苷酸与相邻核苷酸之间的3’-磷脂键，产生5’-磷酸NMP 牛脾磷酸二酯酶：水解5’-末端核苷酸与相邻核苷酸之间的5’-磷脂键，产生3’-磷酸NMP N-糖苷酶 水解碱基与核糖之间的糖苷键 产物为含氮碱基和无碱基末端的寡核苷酸 核苷酸酶 水解核苷酸的磷脂键 产物为核苷和磷酸 常用研究技术 核酸的分离纯化 一般原则： 条件温和，避免断裂 抑制核酸酶，避免降解 区分不同类型核酸 DNA的分离 主要在于除去Pr、RNA 在十二烷基硫酸钠(SDS)存在下用蛋白酶消化细胞，再用苯酚和氯仿除去蛋白酶，用RNase除去RNA，操作在低温下进行，防止过酸、过碱、或机械振荡，可得高质量的DNA 真核生物