《基因克隆-1》-课件设计（公开）.pptVIP

基因工程及体外表达体系（1）.酶 心血管病研究所 王佐 基因工程及体外表达体系 酶 载体 方法 第一节 概述 定义 基本步骤 意义 定义：应用酶学的方法，在体外将目的 基因与载体DNA结合成一具有自 我复制能力的DNA分子（复制 子、重组体），继而通过转化或 转染宿主细胞、筛选出含有目的 基因的转化子细胞，再进行扩 增、提取获得大量同一DNA分子 拷贝，或其表达产物。 Recombinant DNA technology Gene cloning Molecular cloning Gene engineering Genetic engineering 二、基本步骤 目的基因的获得； 目的基因与载体的连接； 重组DNA分子导入受体细胞； 筛选出含重组DNA分子的受体细胞克隆； 克隆基因的表达及表达产物的检测和分离纯化。 三、意义 重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟； 重组DNA技术缩短了进化时间； 重组DNA技术使人能对生物进行定向改造。 基因工程大事记 1973 Cohen第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼 1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计划. 负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程、干细胞 第二节 重要的工具酶 限制性核酸内切酶； DNA聚合酶； DNA连接酶； T4多核苷酸激酶； 碱性磷酸酶。 一、Restriction Endonucleases 1 定义 限制性核酸内切酶（限制酶），是一类能识别和切割双链DNA分子内特定碱基顺序的核酸水解酶。 Restriction Endonucleases Made by bacteria and viruses. Over 500 Restriction endonucleases exist. These will cleave over 80 specific sequences. 2 分类 限制酶可分为3型。 Ⅲ型限制酶在DNA链上有特异切割位点，但其切割位点在识别位点以外。 Ⅱ型酶对DNA水解有很强的特异性，它要求严格的顺序作为切割点。切点顺序中有一个碱基的变异、缺失或修饰，便不再被水解，因此在分子克隆中常用，它被誉为分子生物学家的手术刀。 3 命名原则 从大肠杆菌（E.coli）R菌株分离到的几种限制酶，分别表示为EcoRⅠ、 EcoRⅡ 、 EcoRⅤ等。 4 Ⅱ型酶作用特点 Ⅱ型酶有严格的识别、切割顺序，以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH。 识别顺序一般为4—6个碱基，通常是反转重复顺序，具有180°的旋转对称性,也称回文结构，palindrome,具有对称结构的DNA片段。一条链上的碱基顺序（例如从5‘?3’）和另一条链上从5‘? 3’的顺序完全相同。例如，  5‘ GAATTC 3’ 3’ CTTAAC 5’ RE recognition/cleavage site are palindromic DNA sequences, not palidromic as in “ABBA”.E.x. EcoRⅠ 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5These sites are DNA sequence that are identical on both DNA strands. Q: Which of the following 2 DNA sequences is a potentional RE recognition site?Ⅰ. 5’ AGTTGA 3’ Ⅱ. 5’ GCACGTGC 3’ Q: If show below is ? of a RE site, what is the DNA sequ