基因工程的酶学们基础.ppt

工具酶（instrumental enzyme of gene enginering）是应用于基因工程的各种酶的总称。 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。 到目前为止，常用的工具酶有300多种。 工具酶 一、限制性核酸内切酶及DNA分子的体外切割 二、ＤＮＡ连接酶及DNA分子的体外连接 三、DNA聚合酶 1. 限制性核酸内切酶 限制性内切酶是基因工程中不可缺少的工具酶，有人称之为“基因工程的手术刀”。 限制性内切酶切点专一，它作用于DNA分子，产生特异的DNA片段。 一把特殊的剪刀—限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖 限制性核酸内切酶的发现 E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶 当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。 而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。 仍有少量phage λ (K)可在 E. coli B中生存，是因为E.coli B phage对λ (K)进行了修饰。 R-M系统 细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制—修饰系统(R-M Restriction-modification system)。 R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则会被降解。 个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。 限制性核酸内切酶的发现 1968 Linn和Arber从E.coli B中发现限制酶Ⅰ 1970 Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶Ⅱ 1978 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金 限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。 功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。 （2）分类 根据酶的功能、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶分为三类： Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶 Ⅰ型酶 Ⅱ型酶 1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。 分子量较小（105Da），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg++的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。 识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。 许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重组。基因工程技术中常用Ⅱ型 Ⅲ型酶 这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3’端24~26bp处切开ＤＮＡ，所以它的切割位点也是没有特异性的。 （3） Ⅱ型酶的基本特性 DNA双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。 两个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的 断裂的结果形成的DNA片断，也往往具有互补的单链延伸末端。 限制性核酸内切酶的类型 限制性核酸内切酶的命名原则： 限制性核酸内切酶的活性单位 50μL Buffer中，含1μg底物DNA，于最适反应条件和温度下，保温1小时，能使1μg DNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。 buffer （pH=8.0） ： 50mmol/L Tris-HCl 10mmol/L MgCl2 1mmol/L DTT或巯基乙醇 100μg BSA/ml （DDT：二硫苏糖醇 BSA：牛血清蛋白) 2. DNA的体外切割 （1）限制性核酸酶的识别序列 （2）限制性核酸内切酶的酶切位点 （3）限制性核酸内切酶酶切DNA的方法 （1）限制性核酸酶的识别序列 ①识别序列： 限制性核酸内切酶在双链DNA上能够识别的4~8个核苷酸组成的序列，因限制酶是从其识别序列内切割DNA分子，故识别序列又称限制酶的切割位点，亦称靶子序列。 （1）限制性核酸酶的识别序列 ②回文结构(palindrome) 无论限制酶的识别序列是连续的（如GATC）还是间断的（GANTC），其共同点是识别序列均具有双重旋转对称的结构形式，换言之，这些核苷酸对的顺序是呈现回文结构，有的也称为旋转对称或左右互补对