基因工程α-2b干扰素新型发酵技术及结构修饰与新制剂研究-生物化工专业论文.docxVIP

摘 摘 要 本文一方面从基因工程假单孢杆菌(Pseudomonas putida)发酵微环境入手，研 究了培养基组成和培养条件对菌体生长和干扰素生产的影响。另一方面也对干 扰素进行PEG修饰、剂型改变、药物释放控制进行了研究。 在合适的模糊控制策略下流加葡萄糖可以提高菌体的比生长速率，延长对 数生长期，最终比菌体密度为旧生产工艺的3倍左右。 发酵中，生长最适条件为30℃、pH6．5、DO大于60％，而生产最适条件为 30。C、pH6．0、D040％。30℃恒温培养下基因工程假单孢杆菌发酵后期存在严 重的干扰素降解现象，将发酵温度降低到25℃以下可以有效减少干扰素降解。 以模糊理论为基础，提出了生长生产耦合度概念，定量表征生长和生产的 同步程度。发现基因工程假单孢杆菌发酵中生长和生产不同步，耦合度只有 44％。旧工艺中菌体生长集中在4小时之前，而生产的干扰素只有总产量的20％， 发酵最后一小时生产的干扰素占30％，降温离心阶段生产的干扰素占50％。 采用30℃一20℃的两阶段培养，并采用历时一小时缓慢降温实现生长生产 阶段转换，干扰素产量提高2倍。并发现LB培养基中含有抑制干扰素合成的 物质，全培养基流加不利于菌体生长和干扰素合成。 ．确定了两阶段培养模式及其培养条件。通过生长阶段培养，将5升发酵罐 中菌体密度提高了2。3倍；通过生产阶段培养，将干扰素含量提高了1—2倍。 以平均分子量为5000的单甲氧基聚乙二醇(mPEG)为原料，以酰化试剂 法活化mPEG，对干扰素a．2b进行分子修饰。修饰后的干扰素a-2b热稳定性、 酬酶稳定性分别增加2倍和3倍以上，体内半衰期增加3．3倍左右，_|{千脏分布 率增加4-10倍以上。并对修饰产物分离鉴定、稳定性、体内分布和体内外抗肿 瘤等进行了研究。 采用模仿生物体液环境的仿生学思路制成稳定的干扰素液体制剂，以羟乙 基淀粉．40、柠檬酸缓冲液等成分稳定干扰素，制剂中未使用人血白蛋白、防腐 剂成分，无需惰性气体保护。该制剂在8 9C条件可稳定36个月，并在一定范围 内对温度、振摇、光照和冻融表现出较强的耐受性。 以聚乳酸乙醇酸为材料将干扰素Ⅱ一2b包裹成微囊，具有规整几何形态，平 均粒径为2．337“m，粒径主要分布在O．49rn～601am之间。制备的微囊载药量为 4．16％，包封率不小于98．6％，体外释药实验证明具有很好的缓释效果。 关键词：干扰素，基因工程菌，假单孢杆菌发酵，模糊理论，两阶段培养， PEG修饰，液体制剂，缓释制剂 ABSTRACTBeginning ABSTRACT Beginning with the fermentation microenvironment of recombinant Pseudomonas putida，the effects ofthe medium compositions and cultivating conditions on the growth of Pseudomonas putida and interferon expression were studied．At the same time，the studies on modification with polyethylene glycol(PEG)，liquid formulation，controlled-release systems of interferona一2b were carried on． Under the theory of fuzzy control，adding glucose to the media continuously could increase the growth ratio of biomass and prolong the logarithmic phase，so that the specific somatic density was raised as three times as the forifler production process． In fermentation，the conditions such as temperature30C，pH6．5 and D060％are most advantageous to the logarithmic growth phase and the best conditions for interferon expression are temperature 30℃．pH6．0 and D040％．Under the constant 30℃process． interferon was seriously degraded in the end fer