基因重组人组织激肽释放酶对糖尿病肾病大鼠影响的实验研究-内科学专业论文.docxVIP

基因重组人组织激肽释放酶对糖尿病肾病大鼠影响的实验研究 基因重组人组织激肽释放酶对糖尿病肾病大鼠 影响的实验研究 硕士研究生：程谦 指导教师：赵久阳 教授 专业名称：内科学 摘 要 目的：激肽系统(kinin-kallikrein system，l(1(S)是体内主要的 降压系统之一，由激肽原、激肽释放酶(kallikrein，l(LK)和激肽(kinin) 组成，在调节血管壁的张力、细胞增殖及基质增生等方面具有重要作 用。糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见的慢性 并发症，也是糖尿病患者死亡的主要原因。糖尿病肾病的主要病理表 现为肾小球基底膜增厚，系膜细胞增殖，细胞外基质堆积阻塞肾小球 毛细血管管腔，肾小球滤过功能丧失。是血管内膜功能异常不断加重 的结果。激肽释放酶是激肽系统的主要限速酶，它作用于低分子量激 肽原生成赖氨酰缓激肽(kallidin)即激肽，激肽与其受体结合后，通 过一系列机制可以抑制肾小球系膜细胞增殖、基质增生。本实验目的： (1)利用基因重组技术制各出入组织激肽释放酶。(2)观察糖尿病大 鼠在糖尿病的不同阶段体内激肽系统的活性。(3)将制备出的纯品激 肽释放酶注入糖尿病大鼠体内，观察大鼠肾脏功能和形态的变化，以 探讨基因重组人组织激肽释放酶对糖尿病肾病大鼠影响。 方法：(1)利用基因重组(genetic recombination)制备人组织 激肷释放酶。将人组织激肽释放酶基因片段导入分子杆状病毒体内， 构建pAd．CMv-cHK质粒，转染Sf一9细胞进行病毒扩增，然后再转染给 Hi一5昆虫细胞，进行目标蛋白表达，ELISA方法测定人组织激肽释放 酶的表达量。将制各出的激肽释放酶利用离子交换色谱法(ion exchange exchange chromatography，IEC)、凝胶过滤色谱法(ge卜filtration chromatography，GFC)、亲和色谱(affinity chromatography，AFC) 进行分离，纯化。纯化后人组织激肽释放酶用SDS进行纯度测定。 (2)将健康雄性Sprague-Dawley大鼠经链脲佐菌素 (streptozotocin，STZ)诱导制成糖尿病模型。设正常对照组(Nc)、糖 尿病对照组(删)、人组织激肽释放酶治疗组(DK)。自成模后开始， 分别于第8周，12周，16周留取尿标本。16周后应用硝酸酶还原法、 放射免疫技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组化技术及数字化 影像处理等方法，观察各组大鼠血浆KLK变化，肾组织NO、cJ蝴P、 ET-1变化，肾组织形态改变。 结果： 1．Hi-5细胞以lXl06cells／ml接种，以lOpfu／ml感染复度感染 时表达量最高。感染后培养96小时收获细胞培养上清液，分离、纯化 后测得人组织激肽释放酶分子量为39604Da。 2．DM组与Nc组大鼠比较，体重(body weight，Bw)、组织激肽释 放酶(KLK)活性、肾组织中NO、CAMP含量下降(pO．Ol或pO．05)。 而DM组的血糖(blood glucose，BG)、血肌酐(Blood creatinine，BCr)、 血尿素氮(Blood ureanitrogen，Bun)、肾重体重比值(KW／BW)、内皮 素(endothel in-1，ET-1)、尿白蛋白(urine albumin，Ualb)排泄率、 24h尿蛋白定量均高于NC组(p0。Ol或pO．05)。 3．DK组与NC组大鼠比较，Bw、组织l(LK活性、肾组织中NO、cAM P含量下降(p0．01或pO．05)；而BG、Kw／Bw、Ualb排泄率、24h尿 蛋白定量均高于NC组(pO．01或p0。05)。DM组、DK组间tK；、Bun、 Bw、Kw、Kw／Bw无显著性差异，组织KLK活性、肾组织中NO、cAM P含 量，DK组明显高于DM组(口0．Ol或p0．05)。而血肌酐、Ualb排泄 率、24h尿蛋白定量则显著低于DM组(pO．01或p0．05)。 4．(1)16周时，喇组组织KLK活性明显低于8周时的水平(pO．01)， 明显较NC组降低(p0．001)；而DK组组织KLK活性明显高于8周时 的水平(p(O．05)，该组病变较龋组轻。(2)DK组12周、16周尿白 蛋白排泄率均低于8周时的水平(p0．05)，16周时，DK和DM比较尿 ·2‘ 白蛋白排泄率有显著性差异(pO．05)。(3)16周时，DM组肾组织中 白蛋白排泄率有显著性差异(pO．05)。(3)16周时，DM组肾组织中 NO、cAMP含量则明显低于Nc组(pO．01)；而与DM组相比，DK组肾 组织中NO、cAMP含量较高(pO．Ol和pO．05)。 结论