华蟾素诱导急性单核细胞白血病凋亡的体外研究-内科学(血液学)专业论文.docxVIP

华蟾素诱导急性单核细胞白血病凋亡的体外研究中文摘要 华蟾素诱导急性单核细胞白血病凋亡的体外研究 中文摘要 目的 研究(体外)中药华蟾素对急性单核细胞白血病细胞株U937增 殖的抑制作用，及其诱导U937细胞株凋亡的作用，并初步探讨其可能的 机制。进一步研究华蟾素协同拓扑异构酶II抑制剂(etoposide，VPl6)对 急性单核细胞白血病原代细胞的凋亡诱导作用，从而为临床应用华蟾素提 供体外实验的证据。 方法 ①通过MTT比色分析华蟾素对U937增殖的抑制作用，通过概率 单位回归分析计算华蟾素对U937细胞株的半数致死剂量(IC50)：通过相 关分析证实该抑制与华蟾素剂量及作用时间的相关性；②通过Wright’S染 色、Hoechst33258荧光染色观察凋亡细胞特征的形态学改变；③通过琼脂 糖(Agarose)凝胶电泳、末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)原位标记两个 特异的方法，检测DNA分解片段的产生；④通过流式细胞仪的方法定量 检测磷脂酰丝氨酸(PS)外化的Annexin VoFITC阳性细胞百分数；⑤通过 流式细胞仪的方法，检测华蟾素作用后U937细胞株Bcl．2的表达量；⑥通 过RT-PCR半定量的方法，检测华蟾素作用后U937细胞株Fas、FasL的表 达；⑦通过ELISA的方法，检测华蟾素作用不同时间内U937细胞株的 c—AMP含量，初步探讨华蟾素诱导U937凋亡的可能机制；⑧应用上述方 法，检测华蟾素协同VPl6对急性单核细胞白血病患者细胞的凋亡诱导作 用，通过2x2析因实验方差分析的方法，统计两药协同对诱导原代细胞凋 亡的作用。 结果 ①通过MTT比色分析的方法检测，O．225ug／ml以上浓度的华蟾 素能够明显降低U937细胞株对NBT的摄取活性，具有抑制增殖的作用(P O．01)。而且该抑制作用与华蟾素作用的时间．剂量有显著的相关性 【r20．920，r。0．981，P0．01)。通过概率单位回归分析，计算出华蟾素 24小时的IC50为1．36ug／ml。②通过Wright’S染色、Hoechst荧光染色的 方法观察，O．9ug／ml华蟾素能在体外诱导U937细胞株出现凋亡特征的形 兰塑鲞堡壁墨丝兰簦塑些皇垒塑堡圭塑竺竺竺塞 兰塑鲞堡壁墨丝兰簦塑些皇垒塑堡圭塑竺竺竺塞 一』鲨塑兰望翌塑釜塑坠!兰i兰 态学改变。经Agarose凝胶电泳、TdT原位标记的方法检测，华蟾素能在 体外诱导U937细胞株产生DNA分解片段。通过流式细胞仪的方法检测 Annexin V．FITC，华蟾素能使U937细胞株的磷脂酰丝氨酸(PS)外化， 并与华蟾素具有显著的时间、剂量相关性(r20．924，r50．979，P0．01)。 ③通过流式细胞仪检测anti—Bcl．2．FITC，华蟾素能明显降低U937细胞株 Bcl．2表达(1．8ug／ml华蟾素P=0．002，0．225ug／ml华蟾素P=0．039)。通过 RT-PCR半定量方法，O．9ug／ml华蟾素作用后U937细胞株的FasL表达量 为1．47(FasL／[3．actin)，对照组3．54；Fas表达量为7．72(mFas／p．actin)， 并出现可溶性Fas表达6．99(sFas／p—actin)，对照组为4．94。通过ELISA 方法检测，0．45ug／ml华蟾素作用6小时后，U937细胞株c．AMP含量明显 降低(P0．01)，1 8小时抑制率明显增高(P=0．04)。④体外O．225ug／ml 华蟾素协同拓扑异构酶II抑制剂(VPl6，10ug／m1)作用2天，可增强对 U937细胞株及部分急性单核细胞白血病患者原代细胞的凋亡诱导作用 (P=0．048，P=0．025)。 结论 ①中药华蟾素体外具有抑制U937细胞株增殖的作用，该作用呈 一定的时间．剂量相关性；②该药具有诱导U937细胞株凋亡的作用；③其 诱导U937细胞株凋亡作用，可能通过Bcl一2、c—AMP、Fas、FasL等途径； ④华蟾素在体外能协同拓扑异构酶II抑制剂VPl6，诱导急性单核细胞白 血病患者原代细胞凋亡。⑤华蟾素是一种治疗急性单核细胞白血病有前景 的药物，可辅助化疗药物对白血病的治疗作用。 关键词 华蟾素，急性单核细胞白血病，凋亡 Study Study of Effects of Cinobufacini on Acute Monoeytic Leukemia Cell Line(U937)and Parent Cells Abstraet Objective：In vitro studies on Cellular and Molecular Mechanisms of effects of Cinobufacini which induces huma