华山松疱锈病原菌重寄生菌的筛选及其作用机理初步研究-森林保护学专业论文.docxVIP

摘要：华山松疱锈病是危害华山松林分最为严重的一类病害，其发病面积已达 摘要：华山松疱锈病是危害华山松林分最为严重的一类病害，其发病面积已达 5967。9hm2，对长江防护林体系的建设和西部生态环境的恢复造成了严重的威胁。长 期以来对该病的防治进行过大量的研究并已取得一定成果，但由于某些防治措施在生 产实际、大范围应用中存在着操作困难、难以持久、防治效果不稳定等问题，以致疱 锈病在大部分发病区仍未得到有效控制且仍在继续扩展蔓延。在自然界广泛存在的重 寄生菌，是对植物病原菌有控制作用的一类重要的微生物资源，而应用于植物病害防 治的生防菌多数也是病原菌的重寄生菌．过去报道的华山松疱锈病病原茶蔗生柱锈 (Cronar玎um ribicola J．C．Fischer)的重寄生菌枝顶孢之一种(Acremonium sp．)， 经初步试验表明对锈孢子有明显伤害作用。但由于其分生孢子要在相对湿度大于90，6 的条件下才能萌发，而锈孢子发生期干燥的气候条件限制了该菌的生长繁殖，很难起 到自然控制作用。 为此，本设计从重寄生菌的筛选开始。以重寄生菌对锈孢子的伤害为线索。力求 得到对锈孢子伤害作用大、可作为生防菌开发利用的重寄生菌；研究重寄生菌所产毒 素及胞壁降解酶等作用因子，探讨其作用机理，为华山松疱锈的生物防治奠定基础。 主要研究结果如下： (1)从两省4个采集地采用不同分离方法分离得到真菌212个菌株，已初步鉴 定到属的有139株，分属于8个属；鉴定至Ⅱ种的有61株分属于2个种；未产孢尚不 能判断其归属的有12株。分离结果表现蜾湿感病棱干让锈子器自然长出菌丝体，并 以菌丝体为分离材料的方法比较适于重寄生菌的分离．将各菌株的菌块按种于锈孢予 堆并满足一定湿度，根据菌丝对锈孢子伤害的程度筛选得到6个属的重寄生菌181 株，占分离所得真菌菌株总数的85％，它们是：链格孢Alternaria spp、镰刀菌Fusarium spp．、棒束孢Isaria sp．、jl【盘多毛孢Pestalotiopsis sp．、木霉Tr／choderma spp．及粉红 单端孢Trichothecium rosP．Ii帆(B11lI)Unk。 (2)显微观察发现不同属的重寄生菌作用于锈孢子的方式存在明显差异：一种 表现为菌丝不穿透、锈孢子外形较完好但内含物浓缩、活力降低；另一种表现为菌丝 穿透锈孢子使孢子破裂、表面疣突脱落、变形。由此推断，重寄生菌对锈孢子的伤害 存在毒素和细胞壁降解酶两方面的作用。 (3)选择lO株重寄生菌进行毒素的研究，用其培养滤液处理锈孢子后，锈孢予 所受伤害同于用重寄生菌活菌体接种情况；锈孢子坏死说明培养滤液中含有对孢子有 毒害作用的物质；致死的锈孢子能被台盼蓝染成蓝色说明其细胞质膜完整性已被破 坏。TIC法染色可见孢子内含物浓缩，说明内部结构也受到影响；致死孢子较之仍 坏。TIC法染色可见孢子内含物浓缩，说明内部结构也受到影响；致死孢子较之仍 有活力的孢子缩小、变形。毒素原液处理后。可以根据锈孢子及夏孢子颜色的变化来 判断其是否具有活力，即保持鲜黄色的孢子为活孢子，变自的孢子已丧失活力。研究 还发现，锈孢子活力测定较之测锈孢子萌发率及侵染力更适合予作为毒素的生物测定 方法；锈孢子较之夏孢子更适于作为生物涮定的材料；测孢子活力时台盼蓝染色较之 TIC染色更为直观、简便、准确。 (4)比较供试菌株重寄生蓖毒素原液对锈孢子伤害作用的大小，得知10个菌株 中拟盘多毛孢MM011菌株为强产黼株。通过不同培养条件对MM011菌株生长量 和产毒能力影响的研究，得出该菌株产毒液体培养较适宜的组合，’即PD培养液为基 本培养基质、自然PH值(约为中性)、自然昼夜交替、间歇振荡培养、培养时间为 15d。经初步提取发现其毒素为一类耐高温、非挥发性的大极性物质；进一步的试验 证明MM011的j膊泰对离体枝干上自{}锈子器也有较强的伤害作用，对华山橙幼苗则 是安全的． (5)以锈孢子壁为诱导物对10个供试菌株进行产酶液体培养并对备菌株的培养 液进行几丁质酶和e．葡聚糖酶活性测定，结果显示各菌株均能不同程度地被诱导产 生这两种酶。用备菌株蓐活性最大射的粗酶液处理锈孢予。锈孢子表现出相『司l予活菌 体接种履的破裂、表面瘴究甚至外壁脱落、变形等现露。台盼蓝染色发现外壁被破坏 的锈孢子多数仍为鲜黄色，说明粗酶渡没有影响细胞质膜而只对锈孢子外壁起作用。 即重寄生菌能够分泌胞壁降解酶并酶解锈孢子外壁的骨架成分凡丁质和B前聚糖， 从而使锈孢予受到破坏。 (6)从诱导产酶时间和酶活性滔定的试验结果可知，木霉砌和SS003为几 丁质酶和p．葡聚糖酶韵高产菌株：二者的酶活性与其粗酶眩破坏锈孢子盼强度成正 相关。说明这两株菌作用锈孢子壁的主导因子就是几丁质酶和B-葡聚糖酶。由于这