华支睾吸虫ak3和ldh新基因的克隆与功能特征研究-病原生物学专业论文.docxVIP

华支睾吸虫AK3和LDH新基因的克隆与功能特征研究 华支睾吸虫AK3和LDH新基因的克隆与功能特征研究 中山大学博1：学位论文 华支睾吸虫AK3和LDH新基因 的克隆与功能特征研究 专 业： 病原生物学 博士研究生： 杨光 导 师： 余新炳教授 中文摘要 华支睾吸虫病流行于中国南方、日本、韩国和越南等地。据报道在这些地区 有数以百万计的人因为食用生的或者未煮熟的淡水鱼而感染华支睾吸虫。华支睾 吸虫成虫寄生在肝脏胆管中，大部分感染华支睾吸虫者症状不典型，在轻度感染 和感染早期，没有发现肝脏重量的变化，但在重度感染则出现胆管的阻塞，管壁 增厚，带虫多的患者会发生胆管炎和胆管性肝炎，严重时华支睾吸虫会诱发人的 胆管上皮细胞出现过度增生和瘤性增殖，继发胆结石。在感染华支睾吸虫的仓鼠 中，华支睾吸虫的刺激合并二甲基亚硝基胺药物治疗，会刺激胆管周围的圆形细 胞、胆管细胞和肝细胞的增殖，进而继发肝外胆管癌。肝吸虫侵入引起的慢性损 害合并细胞的增殖在继发胆管癌中可能起到直接的病因作用。多数患者表现为腹 部不适、肝脏肿大、阻塞性黄疸等症状。 细胞内ATP的生成和ATP消耗过程是生物基本能量代谢过程，能确保在广 泛的细胞功能活动中的能量系统的正常运行。腺苷酸激酶(AK)催化ATP或者 GTP与AMP之间高能磷酸键的可逆性转移生成ADP和GDP或者2分子的ADP。其 中AK3是线粒体中GTP和AMP之间的磷酸转移酶生成GDP和ADP。酶量、同工酶 的分布、磷酸流量动力学通过统一的磷酸转移系统与细胞功能联系在一起。这个 磷酸转移网络在能量的有效转移和分布中起关键作用，能确保在应激条件下能量 稳悉。所以AK对于维持活细胞内的腺嘌呤核苷酸的稳态十分重要。目前在华支 睾吸虫的AK3基因序列和其编码蛋白的特征和性质研究尚未见报道。 华支墨吸虫AK3和LDH新基因的克隆与功能特征研究 华支墨吸虫AK3和LDH新基因的克隆与功能特征研究 中山大学博士学位论文 乳酸脱氢酶广泛分布在细菌、植物和动物之中。在脊椎动物中，乳酸脱氢酶 是由四个亚单位组成的四聚体，其亚单位有3个独立的基因座LDH—A。一B，一e 基因所编码。乳酸脱氢酶(LDH)是糖代谢中的一个非常重要的酶，在NADH辅酶I 存在的条件下能催化丙酮酸和乳酸之削相互转化。乳酸脱氢酶的作用还有，在哺 乳动物的过氧化物酶体中，LDH与B氧化系统相偶联并与NADH的再氧化有关。 糖代谢酶被认为是吸虫生命能够存活的关键分子，已经被作为靶标进行疫苗研究 的重要分子。从应用上讲，乳酸脱氢酶在寄生虫感染和一些疾病的诊断中有一定 的意义。通过显微镜检和临床症状确诊的病人或者复发感染疟原虫者，从其血液 中可检测到LDH的活性。在无脊椎动物中，乳酸脱氢酶催化丙酮酸和乳酸之间 相互转化的特性研究还不深入。 研究目的 确定华支睾吸虫AK3的cDNA和其编码蛋白的分子特征包括：酶活性、最适 pH、最适温度、动力学参数、底物特异性、酶活性的抑制剂和其二级结构，了解 华支睾吸虫核苷酸代谢方面的特征。 确定华支睾吸虫LDH的cDNA和其编码蛋白的分子特征、酶活性、最适pH、 最适温度、动力学参数、底物特异性、会属离子对其活性的影响、酶抑制剂、二 级结构、及蛋白结晶条件，了解华支睾吸虫糖代谢方面的特征。 研究方法 从华支睾成虫的eDNA文库中通过大规模测序克隆新基因，利用 NCBl(http：／／www．nlm．nih．gov／BLAST)网站的BLAST-N，BLAST-P去除序列中的 载体部分并在DNA和氨基酸水平上进行同源性分析。开放读码框采用ORF finder(http：／／www．nlm．nih．gov／gorf／gorf．html)程序预测。寻找完整阅读框的起始密 码子和终止密码子。蛋白分析用蛋白组学序列分析工具采用SWISS—MODEL Repository(http：／／www．expasy．eh)分析，预测蛋白质二级结构，以及在PROSITE 数据库内对目的基因编码的蛋白进行功能初步预测； 采用常规方法进行原核克隆和表达并经过SDS．PAGE和Western blot分析鉴 定，采用GST和6×His亲和纯化方法获得可溶性蛋白，蛋白浓度的测定参考 II 华支睾吸虫AK3和LDH新基因的克隆与功能特征研究 华支睾吸虫AK3和LDH新基因的克隆与功能特征研究 中山大学博士学位沧文 Bradford方法。 采用丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶偶联酶方法测定AK3催化GTP和AMP生成 ADP的速度，紫外分光光度计测定偶联的NADH氧化引起在340nm处吸光度的降 低值：CsLDH酶活性测定采用其在体内天然催化丙酮酸和乳酸互变，紫外分光 光度汁测定参与反应的NADH在340m处吸光度的改变。采用酶动力学测定方法 测定其动力学常数。 蛋