细胞培养秋中的研究方法.pptVIP

2.细胞计数 血球计数板计数法 电子计数仪计数法 二、细胞活力测定 细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。? 任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。 1. 细胞克隆形成率实验 测定单个细胞的增殖能力 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能力 克隆形成率比＝克隆形成数／接种细胞数 缺点：操作繁琐 优点：精确、可靠 常见方法：平板克隆形成试验、软琼脂克隆形成试验 3. 四唑盐（MTT）比色法 测定细胞存活和生长。 快速、简单、灵敏度高 3.原位切口末端标记法 （原位细胞凋亡检测，TUNEL） 原理：细胞凋亡时，内源性核酸内切酶使核小体内DNA断裂出现缺口，产生一系列3‘-OH 末端。生物素（biotin）标记的dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下与3‘-OH 末端连接，并与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，加入DAB显色底物可在原位出现棕沉淀，镜下即可观察和计数着色细胞； 正常或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂，因而没有3’-OH 形成，很少能够被染色。 组织样本和细胞样本（细胞涂片）均可检测。 优点：对完整凋亡细胞进行原位染色，能准确反应凋亡细胞典型的生化和形态特征，极少量的凋亡细胞也可被检测出来，灵敏度高于染色法和DNA Ladder，应用广。 注意： 1.设好阳性及阴性对照，控制好药物处理时间 2.TDT酶与生物素-dUTP混合液现用现配 3.DAB显色时间勿过长 4.细胞爬片操作要轻柔 4.流式细胞术测定法 (详见下节) 四、流式细胞术 20世纪70年代出现。 特点：在单细胞水平上对大量细胞作准确 快速分析和分选。 应用： 1.判断细胞体积、DNA含量、蛋白含量、 酶活性、细胞膜受体、表面抗原等。 2.无菌状态下，对活细胞分类收集，纯度 达99%。 流动室、液流系统 激光光源光学系统 光电管、检测系统 计算机、分析系统 工作原理： 1.检测单细胞不同指标 经荧光染色的单细胞悬液在气体压力下进入流动室，在鞘液约束下细胞排成单列从喷嘴喷出，形成细胞流。其与激光束垂直相交，细胞被激发出荧光，经光学系统收集后，传给计算机系统储存、分析并显示。 用不同单克隆抗体或荧光染料，可对一个细胞同时进行多个参数检测。 当细胞液滴逐个通过激光束时，干涉检测器被激活，而带荧光标记的细胞同时也使荧光检测器激活，液滴充电信号使液滴带上负电荷，从而向正极移动，进入荧光标记细胞收集器，纯度达99%以上。 无菌状态下进行时，得到细胞仍可继续体外培养，进行后续研究。 2.细胞分选 流式细胞仪使用 1.调试和校准：激光强度、液流速度、光路等、由专业技术人员进行。 2.仪器操作：①打开细胞仪 ②打开联机电脑 ③在气压阀减压状态下确认鞘液桶充满并保证管路通畅 ④气压阀加压排出管路气泡 ⑤样品管加去离子水冲洗喷嘴系统 ⑥预热5-10min开始试验 完毕后去离子水冲洗 ⑦分析结果 常规样品制备方法 1.直接荧光标记法： 直接用荧光素（FITC、PE等）标记的抗体处理细胞，进行检测（可同时加入几种不同荧光标记的抗体）。 此法操作简单，结果准确，易于分析。 2.间接荧光标记法： 细胞先与一抗结合，再加荧光标记的二抗检测。 此法费用低，但特异性差（二抗多为多克隆抗体），应设好阴阳对照。不适合细胞数少的标本测定。 应用实例 1.检测细胞膜受体 原理：细胞表面保留有完整的抗原，用荧光标记的特异性抗体与细胞表面抗原结合，依荧光强度或阳性百分率可知相应抗原密度。 步骤：①对数期细胞单细胞悬液，PBS洗涤，调浓度为1×107个/ml；②取100ul，加血清封闭；③加抗原避光孵育20min， PBS洗涤2次；④弃上清，用固定液固定细胞；⑤检测 检测结果 * * 细胞培养中的研究方法 侯桂琴 郑州大学药学院 内容提要 一、细胞生长状况观察 二、细胞活力测定 三、细胞凋亡检测 四、流式细胞术 五、常用单细胞分离技术 一、细胞生长状况观察 1.常规观察 2.细胞计数 3.细胞生长曲线 4.细胞分裂指数 5.细胞贴壁率 6.细胞周期 1.常规观察 倒置显微镜下观察，生长状态好的细胞透明度大，细胞内颗粒少，没有空泡。包膜清晰。培养液清澈透明，无悬浮细胞和碎片。 从培养基颜色判断：正常桃红色，当变浅变黄，需换液或传代。 培养液浑浊，液体内漂浮菌