第二章 基因工程的理论基础走与基本技术.ppt

仪器的正确操作 CTAB即十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA 。巯基乙醇作为还原剂使多酚氧化酶失活，可以防止酚类的氧化。 浓度测定步骤 自从琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶被引进核酸研究以来，凝胶电泳已经发展成为一种分析重组DNA分子的重要技术手段，同时也被广泛地应用于DNA 的核酸内切酶消化片段的分析、分离和纯化以及蛋白质的分析和纯化等方面的工作。 （五）、聚丙烯酰胺凝胶银盐染色法 4） 引物3`端碱基最好选T,C,G而不选A,这样有利于延伸; 5） 为了便于后续的克隆可以在5`端加保护碱基和酶切位点。 标准的PCR反应体系 1、引物 各0.1umol 2、 4种dNTP 各200umol/L 3、 10× buffer 10ul 2.5ul 4、 模板DNA 0.1～2ug 0.025～0.5ug 5、Taq酶 2.5u 0.625u 6、Mg2+ 1.5mmol/L 7、ddH2O 加至100ul 加至25ul 3）避免形成引物二聚体（dimer） 两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。 5’GGTCTGCCAGTCTAC3’ 3’CAGGACTTAGTCACT5’ primer1 primer2 Upstream primer vs Downstream primer Sense primer vs Antisense primer Primer1 vs Primer2 Forward primer vs Reverse primer ⑤引物的Tm值 Tm=（G+C)?4 + (A+T)?2 当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55 ℃。 适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。 实际复性温度选择低于Tm值5 ℃。 手工计算： 一般估计： ⑥引物的浓度 一般使用终浓度各0.5?mol/L。 ⑦简并引物 如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。 需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。 设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。 引物设计现在多用专业软件 ⑧套嵌引物（nested primers) 1 3 2 4 如Primer5.0等 Primer 5.0 但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。 （4）模板（template) ② 模板的量： 不能太多，100?l反应体系中100ng足够。 ① 纯度： PCR对模板DNA的纯度要求不高。 dNTPs 是 dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。 （5）dNTPs 一般反应体系中dNTP混合液终浓度用0.2mmol/L。 浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性并增加错配率。 Taq DNA聚合酶要求有游离的Mg2+ 。 （6）Mg 2+ 的浓度 所以Mg2+浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带）。 一般用1.5-4.5mmol/L的MgCl2终浓度。 100ul 25ul 6. PCR技术的延伸技术 （1）荧光实时定量PCR 常规PCR 电泳鉴定产物的量 缺憾 1 无法对初始模板精确定量 2 无法实时监测扩增情况 3 跑胶繁琐、易污染 借助于荧光信号来检测PCR产物。可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据Ct值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。 Real—time? PCR（或TaqMan? PCR ） Ct值：样品到达阈值水平所经历的循环数。 Threshold line C(t) value 阈值：荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准。 C(t)值：荧光信号到达阈值时所经过的扩增循环次数。 荧光强度---循环数曲线 初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线 104 103 106 105 102 10