酶工程中结国药科大学.ppt

把上述制得的固定化E.coli细胞（产青霉素酰化酶）装填于带保温夹套的床式反应器中，就可连续循环转化PG或PV成6-APA。 第五节 酶工程研究新技术 酶工程 新技术 酶 基因工程 酶的 化学修饰 酶 蛋白质工程 （突变酶） 酶分子 定向进化 抗体酶 一、酶的基因工程 DNA重组技术对酶工程的渗透，导致了酶工程产业质的飞跃，一批重要的工业用酶实现了基因克隆与高效表达，为新酶种的开发和酶产量的提高，开辟了新的有效途径。 （一）、重要工业酶制剂的基因工程 在酶制剂的基因工程研究中，α淀粉酶的研究最活跃，美国、日本、瑞士等国都已成功地实现了α淀粉酶的克隆与表达，菌株产酶能力提高了3-5倍。美国CPC国际公司的Moffet研究中心已获得FDA的批准，可用其研制的基因工程菌生产α淀粉酶。这是第一个由FDA批准用基因工程菌生产的酶制剂。 日本科学家将嗜热脂肪芽孢杆菌的中性蛋白酶基因克隆到一个不产酶的突变株中，将质粒重组，再将两个新质粒分别引入嗜热脂肪芽孢杆菌和枯草杆菌，酶活力分别提高到原菌株的18倍和10倍。此外，运用基因重组技术提高葡萄糖异构酶、糖化酶、木糖异构酶、反丁烯二酸还原酶、纤维素酶等酶活力的研究也取得了较好的结果。 （二）、基因工程菌的固定化 Wagner等人（1980）将E.coli ATCC11105的青霉素酰化酶基因克隆到质粒上，获得高酶活重组菌5K（PHM12），并将此菌固定化试图用于生产 。这是基因工程与酶工程技术相结合的第一个实例。Bruce K H等（1985）应用基因重组技术构建了丝氨酸和色氨酸合成酶工程菌，这种工程菌组装的生物反应器可以用苷氨酸和甲醛为原料制造丝氨酸，反应液含丝氨酸超过400g/L，再从丝氨酸与吲哚转化生成色氨酸，反应液中色氨酸浓度达到200g/L。 二、酶的蛋白质工程（突变酶） 蛋白质工程技术是基因工程技术的延伸与发展，它是以蛋白质结构规律与生物功能的关系为基础，通过分子设计、有控制的基因定点诱变改造，对现有蛋白质进行定向改造，创造世界上原来没有但功能上更优越的的蛋白质。 合成寡核苷酸定点诱变酶 目前世界上约有200家生物工程公司从事这项研究，美国的Genentech和Cetus公司居领先地位。他们利用定点诱变法使T4溶菌酶第三位异亮氨酸变成半胱氨酸，因而可和97位的半胱氨酸形成二硫键。新酶与天然酶催化活性相同，但由于增加了一对二硫键，使酶在高温下的稳定性大大增加。 英国皇家理工学院和剑桥大学分子生物学实验室将酪氨酰t-RNA合成酶的第51位苏氨酸变成脯氨酸，结果酶对ATP的亲和力增强，酶活力提高25倍。 德国BM公司应用蛋白质工程技术，对青霉素酰化酶基因进行定点突变改造，构建了新结构青霉素酰化酶工程菌，从而大大延长了固定化青霉素酰化酶的使用半衰期，其固定化酶柱可连续使用700天以上。 三、酶的化学修饰 （一）定义 酶的化学修饰可以简单地定义为在分子水平上对酶进行改造，即在体外将酶的侧链基团通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变酶的酶学性质的技术。 （二）修饰酶的特性 酶的化学修饰在一定程度上可以大大改善天然酶的一些不足之处，这主要表现在：1、热稳定性较天然酶高；2、减少或消除酶的抗原性；3、延长药用酶的体内半衰期；4、增加对蛋白水解酶的抵抗力；5、改善药用酶的组织分布能力。 （三）常用修饰剂： 修饰剂一般要求具有较大的相对分子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面具有较多的反应活性基团及修饰后酶活的半衰期较长。主要有以下几类： ① 糖及糖的衍生物 ：主要有右旋糖酐、右旋糖酐硫酸酯、糖肽、葡聚糖凝胶、聚乳糖等； ② 高分子多聚物：主要是聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVA）、聚（N-乙烯吡咯烷酮）（PVP）、聚丙烯酸（PAA）等； ③ 生物大分子：常用的有肝素、血浆蛋白质、聚氨基酸类等； ④ 双功能试剂：主要有戊二醛、二异硫氰酸、二胺类等； ⑤其它：某些固定化酶载体、糖基化试剂、甲基化试剂、乙基化试剂及某些小分子有机物等。 （四）应用范例 PEG修饰L-门冬酰氨酶。日本和美国利用聚乙二醇（PEG）修饰治疗白血病的特效药L-门冬酰氨酶，使抗原性完全消除，使之更适合用作治疗药物。 四、酶的分子定向进化（Directed evolution in vitro） （一）定义 指无需事先了解酶的空间结构和催化机制，而是人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，使基因发生大量变异，并定向筛选、获得具有某些预期特征的进化酶的技术。从而在几天或几周内实现自然界需数百万年才能完成的事情. （二）目的 在于人为地改变天