基因沉默11β-羟类固醇脱氢酶1型对胰岛β细胞nit-1的功能影响-内科(内分泌与代谢病)专业论文.docxVIP

华中科技大学博士学位论文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE 10 PAGE 10 英文缩略词表 ABBREVIATIONS BSA Bovine serum albumin DEPC Diethyl pyrocarbonate EDTA Ethlene diamine teraacetic acid EB Ethiidium bromide GCs Glucocorticoids H Hour 11β-HSD1 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type1 KD Kilo-Dalton KRBB Krebs-Ringer bicarbonate buffer L Liter Mg Milligram min Minute mRNA Messenger RNA OD Optical density PDX-1 Pancreatic and duodenal homeobox factor-1 PAGE Polyacrylamid gel electrophoresis PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase chain reaction PI Propidium idide PMSF Pheylmethyl sulfonyl fluoride RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction Rpm Round per minute SDS Soculium dodecyl sulfate Tris 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol U Unit 摘 要 背景 全球 2 型糖尿病发病率逐年升高，尤其在发展中国家，我国目前的发 病率约为 5%,仅次于印度居世界第二位。其发病机制主要是胰岛素抵抗和胰岛 β 细胞功能的损伤。胰岛素抵抗是指外周胰岛素敏感组织（主要是肝、脂肪、骨骼 肌）对胰岛素诱导葡萄糖摄取利用下降和肝糖输出增加，导致需要超生理剂量的 胰岛素才能发挥作用；β 细胞功能损伤包括 β 细胞分泌胰岛素的功能和 β 细胞数 量的下降。但损伤的具体机制仍然不清楚。有研究显示局部组织中活性糖皮质激 素的水平与组织的生理功能密切相关，如脂肪组织中糖皮质激素浓度升高促进前 脂肪细胞的分化，引起内脏脂肪的堆积；肝脏组织中糖皮质激素浓度升高增强糖 异生作用，引起高血糖，两者并存导致了中心性肥胖和胰岛素抵抗。组织特异性 11β 羟类固醇脱氢酶 1 型（11β－HSD1）是调节局部组织中糖皮质激素的关键酶， 我们在前期的研究中发现 2 型糖尿病大鼠胰腺中也有 11β－HSD1 表达升高，且 与空腹血糖正相关，与空腹胰岛素、HOMA-β%A 和 AUG-I/G 负相关、与 pdx-1 表 达负相关，为此，本研究利用胰岛 β 细胞株 NIT-1 进一步探讨 11β－HSD1 对胰 岛 β 细胞的功能影响。目的 1.观察在 C57BL/6J 小鼠胰腺和小鼠胰岛 β 细胞株 NIT-1 的表达，为下一步研究提供有效的实验工具；2.将葡萄糖作为影响因素， 研究 11β－HSD1 与胰岛 β 细胞功能之间的关系；3.利用基因沉默技术，特异性 阻断 11β－HSD1 的表达，对胰岛 β 细胞功能的影响。方法 1.细胞免疫组化法 检测 NIT-1 细胞中表达和定位；2. 以肝脏组织 11β－HSD1 为阳性对照，采用 RT-PCR 和 Western 印迹法检测小鼠胰腺组织中 11β－HSD1 基因表达，；3.分别 用含 10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L 和 25mmol/L 的 Ham’s F12 培养基处理 NIT-1 细胞 72h，检测细胞上 11β－HSD1mRNA 和蛋白水平变化，并利用葡萄糖 刺激胰岛素分泌（GSIS）实验评价胰岛 β 细胞功能的变化；4. 构建 siRNA- 11β-HSD1 重组质粒，转染慢性高糖作用下的 NIT-1 细胞，GSIS 实验观察胰岛 β 细胞功能的改变。结果 1. 小鼠胰岛 β 细胞株 NIT-1 细胞胞浆内有棕黄色染色 阳性颗粒；2. C57BL/6J 小鼠胰腺中有 11β－HSD1 表达，其表达量低于肝脏组织 内；3.随着培养基中葡萄糖浓度的增高，NIT-1 细胞上 11β－HSD1 的表达上升， 胰岛 β 细胞葡萄糖刺激下的胰岛素分泌功能下降；4.将构建成功的 siRNA- 11β-HSD1 重组质粒转染慢性高糖作用的 NIT-1 细胞后，能部分恢复下降的胰岛 素分泌功能。结论 1.小鼠胰腺组织和胰岛 β 细胞系 NIT-1 中有 11β-HSD1 基因 表达;2.