人骨髓间充质干细胞成骨及成软骨分化中长链非编码RNA的初步研究-外科学（骨外科学）专业论文.pdf.docxVIP

学校代码：10023学 学校代码：10023 学 号：B2012001060 博士学位论文 (专业学位) 人骨髓间充质干细胞成骨及成软骨分化中 长链非编码RNh的初步研究 所 院： 北京协和医院 姓 名： 王亮 指导教师： 王以朋教授 导师小组： 王以朋教授、吴志宏教授 学科专业： 外科学(骨外科学) 研究方向： 脊柱外科 完成日期： 2015年4月 万方数据 北京协和医学院博士研究生学位论文目录 北京协和医学院博士研究生学位论文 目录 中文摘要 ．．1 前言 ．． ． 7 正文 9 实验材料 ．．9 第一部分 人骨髓间充质干细胞成骨分化中IncRNAs的研究 ．12 实验方法 ．12 实验结果 ．27 讨论 ． 433 结论 ． ．47 第二部分 人骨髓间充质干细胞成软骨分化中incRNAs的研究 ．．48 实验方法 ．48 实验结果 523 讨论 ．．67 结论 ．700 参考文献 ． 72 英文缩略词表 ． ．．． ．．． ．． ． ．．74 综述 ．．75 致谢 ．．81 个人简历 ．． ． ．82 独创性声明 ． ．． ．．83 万方数据 北京协和医学院博士研究生学位论文中文摘要 北京协和医学院博士研究生学位论文 中文摘要 研究背景 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于中胚层的多潜能干细 胞，其具有很强的自我更新和多项分化潜能。在给予适宜的体内或体外诱导环境下， 其可分化为成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞等。间充质干细胞是骨与软骨组织工程研 究常用的种子细胞，在再生医学研究中具有广阔的应用前景。骨髓来源的间充质干细 胞因获取和培养简单方便，是目前使用最为广泛、研究最多的间充质干细胞。间充质 干细胞的成骨、成软骨定向分化是干细胞研究的热点，目前其具体的定向分化机制仍 不明了。 长链非编码RNA(10ng non—coding RNA，lncRNA)是一类转录本长度超过200nt、 不编码蛋白的RNA。其占到非编码RNA的80％以上，但却是目前研究及了解最少的一 类RNA。其不具有蛋白编码功能，但研究发现lncRNA在生长发育与分化过程中发挥重 要作用。lncRNA具有复杂的生物学功能，参与机体诸多生物学行为，并与人类疾病的 发生、发展和防治有密切的关系。然而关于IncRNA在人骨髓间充质干细胞成骨、成 软骨定向分化过程中的作用尚无系统的报道和研究。该研究对于间充质干细胞定向分 化过程中的incRNAs进行了初步筛选，为后续的机制研究奠定了基础。 目的 1．对人骨髓问充质干细胞进行成骨及成软骨诱导分化，为筛选与定向分化有关的 IncRNA提供细胞样本。 2．利用Agi lent human IncRNA+mRNA Array V4．0微阵列芯片技术分别筛选人骨髓 间充质干细胞成骨分化组与未分化组、成软骨分化组与未分化组之间差异表达的 lncRNAs和mRNAs。 3．利用生物信息学技术对差异表达的IncRNA和mRNA进行分析，筛选可能参与定 向分化过程的lncRNA，预测其潜在的生物学功能。 研究方法 1．对人骨髓间充质干细胞进行细胞培养，对P3 MSCs分别进行成骨及成软骨诱导 分化，分别设立实验组及对照组。在诱导分化后Day 14进行细胞染色及相关基因的 万方数据 北京协和医学院博士研究生学位论文检测进行诱导分化的验证。 北京协和医学院博士研究生学位论文 检测进行诱导分化的验证。 2．分别取3个成骨诱导分化、3个成软骨诱导分化和3个正常培养未分化Day 14 的细胞样本作为芯片检测样品，提取细胞样本的总RNA。经质控合格后，利用 Agi ient human IncRNA+mRNA Array V4．0微阵列芯片技术对定向分化组与对照组之间 差异表达的incRNAs和mRNAs进行筛选。 3．通过Gene Ontology、Pathway分析以及构建IncRNA和mRNA的共表达CNC网 络图等生物信息学分析，进一步分析差异表达的incRNAs，筛选可能与定向分化有关 的IncRNAs，初步探讨其生物学功能。 4．采用qRT-PCR对芯片检测结果进行验证，并检测感兴趣的相关的incRNAs在定 向分化过程中的动态表达情况。 研究结果 1．我们对MSCs原代细胞进行培养，在传代培养至P3时分别进行成骨及成软骨诱导 分化。我们采用ALP、茜素红染色及成骨相关基因ALP、Runx2及Col I的检测进行成骨 分化的鉴定。对于成软骨分化，阿利新蓝染色、免疫组化染色(Aggrecan、